第十三章 紫外-可见分光光度法.pptVIP

第十三章 可见与紫外分光光度法 UV-Vis Spectrophotometry 分光光度法：根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定量定性分析的一种分析方法。 灵敏度高(检出限 10-5~10-6 mol?L-1, 微量及痕量组分) 准确度较高: 相对误差2% ~ 5% ，若使用精密仪器相对误差可降至1 % ~2 % 。 13.1 物质的吸收光谱 M (基态) + h? → M* (激发态) 吸收光谱讨论 同一物质对不同波长光的吸光度不同，吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。 不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，λmax不变；而对于不同的物质，它们的吸收曲线形状和λmax不相同； 紫外－可见吸收光谱的峰位（ λmax 、λmin、 λsp ）反应分子的电子结构特征，可为物质结构的研究提供重要信息。 注 意 吸收光谱体现了物质的特性，是进行定性、定量分析的基础。 吸收光谱特征是定性分析的依据。 结构完全相同的化合物应有完全相同的吸收光谱，但吸收光谱完全相同的化合物不一定是同一化合物。 溶液浓度↑，A↑，是定量分析的依据。 13.2 分光光度法基本原理 一、透光率和吸光度 二、Lambert-Beer law 1760 年， Lambert 指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。 A = k1· b 1852年，Beer 指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。 A = k2 · c 将 Lambert 定律和 Beer 定律合并起来，就得到 Lambert-Beer 定律。 ? ：摩尔吸光系数（L·mol-1·cm-1） 是物质在一定温度、一定波长和溶剂条件下的特征常数，不随浓度 c 和光程长度 b 的改变而改变，? 仅与吸收物质本身的性质有关； 同一吸收物质在不同波长下的 ? 不同； ? 表明了该吸收物质的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的灵敏度。 ?↑，该物质的吸光能力↑，用光度法测定时灵敏度↑ ，? 1000即可进行分光光度法测定。 a：质量吸光系数（L·g-1·cm-1） 若用质量浓度? ( g?L-1 )代替c ( mol?L-1 ) ：比吸光系数 当溶液组成标度为10 g?L-1时，吸光系数可用比吸光系数 表示 例. 测试酶与腺苷酸(AMP)混合体系的吸光度如下：A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0.58 试计算每一组分的浓度。 已知：酶的?(280nm) = 2.96?104 L?mol-1?cm-1 ?(260nm) = 1.52?104 L?mol-1?cm-1 AMP的?(280nm) = 2.4?103 L?mol-1?cm-1 ?(260nm) =1.5?104 L?mol-1?cm-1 吸收池厚度为1.00 cm。 解：设酶和AMP的浓度分别为y和z，因吸光度的加和性 ?为260 nm时： 0.58 = 1.52?104?1.00 ? y + 1.5?104?1.00 ? z ?为280 nm时： 0.46=2.96?104?1.00 ? y + 2.4?103?1.00? z 解方程得：y = 1.4?10-5 mol?L–1 z = 2.5?10-5 mol?L-1 棱镜 棱镜有玻璃和石英两种材料。 它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 ~ 3200 nm的波长范围，即可见光域内。 石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外光域。 光栅 光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的。 它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。 它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。 缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。 TU-1810 二、定量分析方法 13.4 分光光度法的误差和测量条件的选择 一、分光光度法的误差 仪器测量误差 光电管的灵敏性差、光电流测量不准、光源不稳定、读数不准 主观误差 操作不当引起，如步骤不规范，显色剂用量、放置时间、反应温度等。 （三）空白（参比）溶液的选择：测定必