16-2 NASBA检测新技术简介.ppt

NASBA 检测技术简介 背 景 什么是 NASBA? 核酸依赖性扩增（Nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）检测技术是一项以RNA为模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法，该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7 RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。 T7 RNA 聚合酶 T7 RNA 聚合酶是一种以DNA为模板合成RNA的聚合酶，其只有在有特异性的启动子序列存在的情况下才能发挥作用。 引物和探针 引物 1 (P1): 用于靶基因（正义 RNA)的特异性的反转录。其5’端带有一段T7启动子序列. 引物 2 (P2):用于靶基因（反义 RNA)的特异性的反转录。 探针: 一种分子信标探针，其使检测结果能过被实时观察。 分子信标探针作用原理 什么是分子信标探针? 反应分为两个部分进行 非循环相: 循环相 NASBA反应原理 实时检测（分子信标探针） H5N1 NASBA特异性分析 临床标本的检测结果 灵敏度分析 H5N1 NASBA可信度分析 主要试剂及耗材 质控设置 阴性对照：同样本同时提取样本水 阳性对照：H5N1病毒核酸或试剂盒提供的体外转录RNA。 空白对照：RNase-free Water。 反应体系 反应检测 结果分析 样品检测信号值（WT signal）：在扩增过程中分子信标探针与靶基因发生特异性结合后，产生荧光信号的荧光信号被收集经软件转换后的强度值，即WT signal。 阈值（threshold）：在NASBA 反应过程中会产生荧光信号，阈值是判断阴性或阳性结果的荧光信号界线值，样本荧光信号≥阈值者为阳性，反之为阴性。 结果分析 结果判断：以1.2倍的阴性对照荧光信号值作为阴性判断的阈值，首先是质控系统判断，即阳性对照WT Signal必须要大于阈值，空白样本小于阈值，否则系统检测无效。当系统检测是有效时，判断待检样本结果，待检样本的WT Signal≥阈值判断为阳性样本，＜Threshold WT时判断为阴性样本。 问 题 何谓NASBA？ 何谓分子信标探针？ NASBA与PCR的差别？ NASBA结果的判断？ NASBA的应用？ * * 高荣保 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 国家流感中心 快速 灵敏 特异 自动化 酶混合物（ Enzyme Cocktail） 逆转录酶 核糖核酸酶H T7 RNA聚合酶 逆转录酶: AMV 鸟骨髓细胞瘤病毒逆转录酶（Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase ，AMV RT)，其具有以RNA，DNA或者RNA/DNA为模板合成DNA的功能。 核糖核酸酶H (RNase H): RNase H (Ribonuclease H ) 能够特异性降解DNA/RNA杂合子中RNA的磷酸二酯键，从而使DNA/RNA杂合子中的RNA降解。 F Q G Q F Molecular beacon DNA probe NASBA RNA Isothermal amplification Hybridization 促灭基团 荧光基团 Loop Stem 带有颈环结构两端被修饰（荧光基团和荧光促灭基团）的双链DNA探针 特异性检测序列（loop）长度 为20-25bp 6-7 bp颈部（stem）互补序列 针对不同的靶基因可以使用不同的荧光标记 G Q F RNA DNA/RNA杂合体 P1 P2 双链DNA cDNA RNA RNA聚合酶 AMV RNaseH AMV P2 RNA DNA/RNA杂合体 P1 P2 双链DNA cDNA RNA RNA聚合酶 AMV RNaseH AMV P2 RNA聚合酶 RNA聚合酶 F Q oligo P2 RT RT T7 RNAP anti-sense RNA RNase H oligo P1 oligo P1 RNase H oligo P2 sense RNA T7 RNA polymerase Target specific molecular beacons Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase Q F Q F Molecular beacon hybridization F Q 非循环相 循环相 F Q F 0 10 20 30 40 50 60 Time (minutes) Normalized fluorescence Q F Q F F Q F