ELISA、酶标仪、洗板机（上海交通大学）.ppt

赵文娟 上海交通大学药学院 酶标（ELISA） ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。 以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术 自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 ELISA技术原理 1. 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 2. 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。 3. 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 4. 受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。 5. 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 6. 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。 酶标基本步骤 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml 37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELX808酶标仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 洗涤 洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。 目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质 洗涤步骤： 1. 吸干孔内反应液； 2. 将洗涤液注满板孔； 3. 放置2min，略作摇动； 4. 吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。 洗板机 手工洗涤流速较难控制，步骤繁琐且耗费时间，目前市面上多种洗板机可供选择，其中以美国宝特的BIO-TEK ELX50 洗板机最为突出 洗板机优势： 自动化控制 精确度高 速度快（最快小于20S每板/每循环） 洗板机使用注意事项 1、?有一定地洗涤次数：多次洗涤有利于取得好的效果，一般不超过6次。 2、?注意每孔的加液量：以加满为宜，但不可溢出，一般为每控300微升。 3、?建议在洗涤前进行位置调节，吸针要到微孔底部，以降低残留量。因为一般ELISA实验洗涤结束后要求扣板，但此步骤在PCR-ELISA中易造成污染，故残留量应尽量减少。不能象一般ELISA操作一样用力扣板。 4、?建议用户采用两点吸液与底部冲洗方式，以得到好的洗涤效果。 5、?如果作PCR-ELISA液罐应加有1%次氯酸钠，加入的量不得少于产生废液的量。每天使用完毕后应用1%次氯酸钠冲洗管路及清洗头，然后用双蒸水冲洗管路。 6、?定期维护、检修仪器及配件。 洗板机的应用范围 所有涉及到96孔板换液、孵育、洗涤的实验： ELISA 荧光ELISA 细胞洗涤 In Cell Western …… 酶标仪的检测原理 酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。 检测单位： 　　光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。 　　检测单位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。 在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波