第九章-亲和纯化技术.pptVIP

亲和纯化技术 （Affinity purification） 1.生物亲和作用（bioaffinity）：生物物质，特别是酶和抗体等活性物质，具有识别特定物质并与该物质的分子结合的能力。这种能力具有排他性。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用。 2.利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术 第一节 亲和层析 第二节 其它亲和纯化技术 亲和过滤 亲和萃取 亲和反胶团萃取 亲和沉淀 亲和电泳 1.定义 利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。 聚丙烯酰胺凝胶 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 设 KL=10-7，求[L0] 1+[L0]/ KL ≥10，将KL =10-7代入得：[L0]/10-7≥9，所以，[L0]≥9×10-7 离子效应作用，又有疏水作用， 弱生物特异性相互作用系统： 离子效应+疏水作用，增强结合力 高亲和性系统： 高浓度盐+有机溶剂 最佳配基浓度、pH、离子强度、温度 专一性洗脱 S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） 竞争效应：ESIEI稳定性，I ，E洗脱出来 非竞争效应：ESI=EI，不能洗脱 反竞争性效应：ESIEI稳定性，I使ES结合紧，I ，E洗脱出来 七、其他亲和层析技术 （一）生物亲和层析 （二）免疫亲和层析 （三）金属离子亲和层析 （四）有机染料亲和层析 （五）拟生物亲和层析 （一）生物亲和层析 利用自然界存在的生物特异性相互作用的物质对 酶-底物，酶-抑制剂，激素-受体 专一性强 配基—天然，价格较贵 匹配关系不清楚或无特异结合物质对的蛋白不能使用此方法 （二）免疫亲和层析 以抗原-抗体的一方作为配基亲和吸附另一方的分离系统 单克隆抗体为配基，分离纯化目标蛋白 单抗—昂贵，适用于小规模使用 （三）金属离子亲和层析 利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统 将环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。 例： 壳聚糖涂层固定化CU2+亲和层析SOD 固定化CU2+亲和层析分离大肠杆菌细胞提取物，不同条件洗脱得到细胞色素C和溶菌酶 （五）拟生物亲和层析 利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某些特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白质的亲和层析 氨基酸（多肽）亲和层析、染料亲和层析 第二节 其他亲和纯化技术 一、亲和过滤 二、亲和萃取 三、亲和反胶团萃取 四、亲和沉淀 五、亲和电泳 一、亲和错流过滤 1.原理： 亲和层析+超滤 基质及大分子亲和配基 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体； 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。 3.所需膜： 对溶剂具有高渗透性 分子截留范围窄 具有相应的机械强度、化学及热稳定性 抗污染能力强 易清洗灭菌 操作寿命长 1.原理： 短粗型亲和层析柱有利提高分离操作速度 微孔膜：柱高无限低，柱径无限大 亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流透过膜的过程中目标蛋白与配基接触而被吸附 2.优点： 传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高 压降小，流速快，设备体积小，配基用量低 3.缺点： 理论塔板数很低，吸附和清洗效率低 膜的污染、膜孔堵塞使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降 五、亲和电泳 亲和+电泳 将亲和层析的吸附剂包埋到琼脂凝胶板上制成亲和电泳（AEP）载体，电泳时，对配基具有亲和作用的化合物迁移下降或包留在原点。 思考题 1.定义：亲和层析、亲和膜分离、亲和萃取、亲和反胶团萃取、二次作用亲和沉淀、金属离子亲和层析（了解） 2.亲和层析中在载体和配基间插入一个“手臂”的原因是什么？ 3.亲和层析中常用的洗脱方法有哪些？ 作业题 比较吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析四种层析技术并填写下表 * 亲和萃取纯化过程 亲和分配（进料）， 杂蛋白反萃取（清洗） 目标产物反萃取（洗脱）。 * 三、亲和反胶团萃取（Affinity-based  reversed micellar extraction） 定义：指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂； 通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，