17.Chapter17 基因工程和蛋白自工程.pptVIP

第十七章 基因工程和蛋白质工程 基因工程的概念 基因工程的基本步骤 蛋白质工程 第一节 基因工程的概念 一、基因工程的含义（又叫基因操作、DNA重组技术、基因克隆、分子克隆）： 指将不同的DNA片段按人们的设计方案定向连接，并在特定受体细胞中与载体一起得到复制与表达（70年代，基于DNA限制新性内切酶、DNA连接酶的发现）。 二、限制酶(限制性内切酶) 一)、限制酶的命名和意义 二）、限制酶的分类 常用的DNA限制性内切酶的专一性 三、基因载体 必须条件： 1、能自主复制或随受体细胞染色体DNA一起复制 2、易于鉴定和筛选 3、限制酶对其作用的切割点少 4、易于引入受体细胞 二）、噬菌体和病毒 第二节 基因工程的基本步骤 基本步骤： 一、目的基因的制备 一）、DNA文库 1、基因组文库 2、cDNA文库 二）、获取目的基因的方法 1、DNA片段直接提取 2、从基因组文库和cDNA文库获取 3、用PCR技术扩增目的基因 4、用化学合成目的基因 二、外源DNA与载体连接 三、重组DNA导入宿主细胞 转化、转导、转染 四、重组体的筛选 1、插入失活法 2、核酸杂交法 3、免疫测定法 4、PCR扩增法 五、克隆基因的表达 真核生物基因转移到原核生物表达，必须考虑： 1、真核基因与原核基因结构上的差异。 2、真核基因与原核基因具有不同的启动子，RNA聚合酶的结构也不同。 3、真核mRNA5’端有甲基化鸟苷“帽”结构，3’端有poly“尾”结构。细菌没有。 4、翻译中，真核mRNA无Shine-Dallgarno序列，不能很好的通细菌核糖体结合。 5、细菌的蛋白酶，能识别外来真核基因所产生的蛋白质分子，并降解之。 第三节 蛋白质工程 一、蛋白质工程的概念 二、蛋白质工程的一般技术 一）、蛋白质工程的理论设计 二）、定点突变技术 1、基因的化学合成 2、基因直接修饰法 3、盒式突变技术 三、蛋白质工程的应用示例 一）、蛋白质工程酶 1、改变酶的催化活性 2、改变酶的底物专一性 3、提高酶的稳定性 4、改变酶的反应特性 5、产生新酶 二）、药物研制 * * 原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。 Eco R I 序号 属名 种名 株名 限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。 例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶 I型：分子量大于105，多亚基，需S-线苷蛋氨酸、ATP和Mg2+ ，识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限制与修饰相排斥的多功能酶. Ⅱ型：分子量小于105，需Mg2+ ，切割位点位于识别 位点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物学研究所用的限制性内切酶均为此类。 ⅡI型：识别位点为5-7bp的非对称序列 ，切割位点在顺序之外离识别 序列5-10bp，切割双链，个别也切割单链。是限制与修饰相多功能酶. 三）、限制酶的识别及切割位点 限制酶识别的序列具有二次旋转对称性。 限制酶酶切产生平头末端或粘性末端。 5′—G—T—T—A—A—C—3′ 3′—C—A—A—T—T—G—5′ 5′—G—T—T A—A—C—3′ 3′—C—A—A T—T—G—5′ 平头末端 Hpa Ⅰ 5′—G—A—A—T—T—C—3′ 3′—C—T—T—A—A—G—5′ 5′—G T—T—A—A—C—3′ 3′—C—A—A—T—T G—5′ 粘性末端 EcoRⅠ 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有400～500多种。 酶 辨认的序列和切口 说明 ‥ ‥A G C T ‥‥ ‥ ‥T C G A ‥ ‥ ‥ ‥G G A T C C ‥‥ ‥ ‥C C T A G G ‥‥ ‥ ‥A G A T C T ‥‥ ‥ ‥T C T A G A ‥‥ ‥ ‥G A A T T C ‥‥ ‥ ‥C T T A A G ‥‥ ‥ ‥A A G C T T‥‥ ‥ ‥T T C G A A ‥‥ ‥ ‥G T C G A C ‥‥ ‥ ‥C A G C T G ‥‥ ‥ ‥C C C G G G ‥‥ ‥ ‥G G G C C C ‥‥ Bam H I