生物分离考研课件第7章.ppt

第七章 液相色谱 7.1 色谱原理与分类 7.2 色谱过程理论基础 7.3 分离度 7.4 凝胶过滤色谱 7.5 离子交换色谱 7.6 疏水性相互作用色谱 7.7 色谱聚焦 7.8 反相色谱 7.9 羟基磷灰石色谱 7.10 超临界流体色谱 7.11 流通色谱 7.12 置换色谱 7.1 色谱原理与分类 1.色谱原理 色谱是根据混合物中，溶质在互不相溶的固定相和流动相两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。 2.色谱分类 流动相 气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法 生物物质的分离主要采用液相色谱 固定相的形状 液相色谱：纸色谱、薄层色谱、柱色谱 分配机理 凝胶过滤层析，离子交换层析，疏水性层析，反相层析，亲和层析。。。 压力 低压（压力低于0.5MPa），中压（压力为0.5～4MPa），高压（压力4～40MPa） 蛋白质分离一般为中低压，介质相对较软，分析多用高压层析，介质多为硬质硅胶等。 轴向色谱与径向色谱 7.2 色谱过程理论基础 平衡模型 认为溶质在固定相和流动相中的分配平衡均瞬间完成，柱内任意位置都达到平衡。 理论板模型 分配平衡需要一定柱高才能完成。 达到一次分配平衡的层析柱段称为一个理论板，该柱段的高度称为理论板当量高度。 理论板数越多，洗脱峰越窄，溶质之间的分离程度越好。 增加柱长，可提高分离效果。 传质速率模型 传质与轴向扩散的影响。 降低流速，减小介质粒径，可提高理论板数，即提高分离效果。 降低流速会增加时间，减小粒径会增加操作压力。 7.3 分离度（resolution） 两个相邻洗脱峰之间的距离的与两峰宽之和的1/2的比值。 R=1.5两物质分离度达99.7%, 可认为完全分离； R=1 两物质分离度达98%, 分离良好 7.4 凝胶过滤（gel filtration chromatography） 又称分子筛层析、体积排阻层析，是用具有网状结构的凝胶粒子为固定相，根据样品的分子大小进行分离的一种层析方法。 大分子不能进入凝胶空隙走的快，小分子能进入而移动较慢而得到分离。 一、 凝胶过滤介质 凝胶过滤层析常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和脱盐，良好的凝胶过滤介质应满足以下要求： 亲水性高，表面惰性 ，介质和溶质间不发生任何物理或化学作用。 稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围内及化学试剂中稳定，使用寿命长，易消毒灭菌。 孔径分布均匀，即孔径分布范围窄 凝胶颗粒大小均匀 机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。 凝胶介质的特性参数： 排阻极限 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量。 分级范围 能为凝胶能阻滞，且相互间可得到分离的溶质的分子量范围。 溶胀率 干凝胶经水溶液溶胀后每克干凝胶所吸收水分的百分数。 凝胶的粒径 凝胶一般为球形，粒径越小，分离效率越高。粒径多用筛目或微米表示。 床体积 1g干燥凝胶溶胀后所占的体积，可用于估算装满一定体积层析柱所需的干燥凝胶量。 空隙体积 指层析柱中凝胶之间空隙的体积。采用分子量大于排阻极限的溶质测定，一般使用分子量2000kDa的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。 凝胶过滤介质可分为多糖类和合成大分子两大类，主要的品种有葡聚糖系列、琼脂糖系列、聚丙烯酰胺系列、Sephacryl系列、Superdex系列、聚乙烯醇系列。 葡聚糖系列（Sephadex） Sephadex是由葡聚糖（由葡萄糖经a-1,6糖苷键连接而成的线性高分子）经环氧氯丙烷交联而成的珠状凝胶。 交联度越高，凝胶孔径越小。 Sephadex 分为G10~G200, 型号命名: 溶胀率×10 琼脂糖系列 以β-D-半乳糖和3,6-脱水-α L-半乳糖为基本单位构成的线性多糖 （b） Sepharose系 Sepharose，非交联结构，仅能在2~40℃ 使用琼脂糖含量为2% ,4% ,6%的产品命名为2B、4B、6B。 Sepharose CL 利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶