SDS-PAGE电泳的常见问题解析（FAQ）.PDFVIP

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions SDS电泳的常见问题解析 （FAQ ） 1. 关于凝胶的一些问题 1. 胶的凝结不好 ，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下 ，在分离胶的下部有波浪样的花纹 ， 凝胶不均匀。解决方法 ：加大 TEMED和过硫酸胺的量 ，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板 ，防止有残 留的胶干结在玻璃板上。 2. 胶不凝 ，解决方法 ：温度较低时加大 TEMED和过硫酸胺的量 ，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新 配制一下缓冲溶液。 3. 胶易碎 ，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法 ：首先在上述过程中一定要 动作轻缓 ，其次在室温较高的情况下可以适当减少 TEMED和过硫酸胺的量。 4. 电泳完后胶上有很多长条纹的杂带 ，解决方法 ：建议电泳缓冲液不要回收利用。配制胶的溶液一定要纯。 2. 凝胶时间不对 通常胶在 30分钟到 1小时内凝。如果凝的太慢 ，可能是 TEMED ，AP剂量不够。 如果凝的太快 ，可能是 AP 和 TEMED用量过多 ，此时胶太硬易裂 ，电泳时易烧胶。 3. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳的影响 前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致 ；后者是由于在解除制胶的夹子后 ，板未压紧而致空气进入引起 的 ，一般对电泳结果不会有太大的影响。 4. 样品的处理 根据样品分离目的不同 ，主要有三种处理方法 ：还原 SDS处理、非还原 SDS处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。 1. 还原 SDS处理 ：在上样 buffer 中加入 SDS和 DTT （或 Beta巯基乙醇 ）后 ，形成 SDS与蛋白相结合的分 子。 Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB （ ） 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 2. 带有烷基化作用的还原 SDS处理 ：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保护 SH基团 ，得到较窄的谱带 ；另 碘乙酸胺可捕集过量的 DTT ，而防止纹理现象的产生。100uL样品缓冲液中加入 10uL20%的碘乙酸胺 ，并 在 25℃下保藏 30min。 3. 非还原 SDS处理 ：生理体液、血清、尿素等样品 ，一般只用 1%SDS沸水中煮 3min ，未加还原剂 ，因而 蛋白折叠未被破坏 ，不可作为测定分子量来使用。 5. 条带两边翘起中间凹下的原因 （︶ ） 在较厚的凝胶中 ，由于凝胶不均匀冷却 ，中间部分凝固不好。 电泳系统温度偏高。 处理办法 ：待其充分凝固再作后续实验。 6. 条带两边向下中间鼓起的原因 （︵ ） 一般原因是两板之间的底部间隙气泡未排除干净 ，或聚合不完全。 处理办法 ：可在两板间加入适量缓冲液 ，以排除气泡。 7. 条带偏斜 原因 ：电极不平衡或者加样位置偏斜。 8. 条带两边扩散 原因 ：加样量过多。 9. 电泳的条带过粗 电泳中条带很粗是常见的事 ，主要是浓缩胶的原因。 处理办法 ：适当增加浓缩胶的长度 ；保证浓缩胶贮液的 pH正确 ；适当降低电压。 10. 目的蛋白质条带模糊 1. 电泳凝胶浓度选择不当。 2. 低于 10Kd 的小分子蛋白质要用 Tricine胶。 Tel: 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB （ ） 活性蛋 白整体 方案