线粒体能量代谢和DNA复制对小鼠卵子体外成熟、受精及发育的影响.pdfVIP

解 剖 学 报 44卷，5期 0XPHOS活性或mtDNA的复制，抑或是两者的结合管，液氮反复冻融2次，裂解细胞，释放DNA。 Green 至今仍无法明确。 mtDNA定量采用SYBRRT—PCR绝对定量法。 RT．PCR 5’- 事实上，OXPHOS活性和mtDNA复制可被独立 弓I 物 序 歹0 为 7 地抑制。羰基氰4．(三氟甲氧基)苯腙[carbonyl 和 5’- PCR cyanidep-(t“一nuromethoxy) 7； 总体积 phenyl-hydrazone， FccP]是一种质子转运载体，可通过降低跨膜电位， 使氧化和磷酸化解耦联，从而抑制ATP的合成∽]。 2’，3’-双脱氧胞苷(27，37一dideoxycytidine，ddc)是一每个样本重复3次。根据标准曲线计算卵子 核苷类似物，可替代正常核苷参与mtDNA的合成，mtDNA拷贝数。 但由于ddC缺乏3’一OH，导致其他核苷无法连接造4．卵子线粒体膜电位(△姗n)检测 成合成终止，从而有效抑制mtDNA的复制o7I。因 △皿m检测采用JC-1荧光染料法进行。卵子经 此，本研究在小鼠卵子体外成熟(maturation梳口i￡ro， IVM)过程中引入FCCP或ddC，建立OxPHOS活性淬灭剂装片，以配有制冷CCD的倒置荧光显微镜观 和mtDNA复制抑制模型，通过比较分析各组卵子成 熟、受精和发育的差异，以区分这两个功能的作用。 红色荧光；较低时Jc一1则为单体，FITC通道下发绿 色荧光。通过红／绿荧光的强度比来衡量△1王rm强 材料和方法 度。 1．卵子获取和体外成熟培养 含量检测 选择体重25～309，4—6周龄的雌性和体重超 过209的雄性IcR系小鼠为实验动物。雌鼠每只腹 卵子ATP含量检测采用荧光素-荧光素酶反应 mare 腔注射10Iu孕马血清促性腺激素(pregnant的发光法进行。检测试剂盒来自美国S培ma公司， semm BenholdLB gonadotropin，PMSG)，46h后，颈椎脱臼处死9501发光仪检测；参照试剂盒说明检测 小鼠，获取卵巢，镜下穿刺卵泡，吸取卵丘．卵母细胞 卵子和ATP标准品的相对发光量(RLU值)，并计算 卵子的ATP含量。 复合体(cumulus—oocytecomplexes，COCs)。选择形 态完整的cOCs，随机分入FcCP一10nm01／L组(13406．小鼠体外受精与胚胎培养 枚)；FCCP-100nmol／L组(1396枚)；ddC．10¨mol／L分离雄鼠附睾，体视镜下刺破附睾尾部让精子 组(1202枚)；ddC一100斗mol／L组(1222枚)；空白对 照组(control，1268枚)，并在IVM微滴[每滴100仙l，(1—2)×109／L；精卵共孵育4～5h；检出卵子，并 tube 人输卵管液(humannuid，HTF)