CARbacillus菌亚单位核糖核酸RNA跟制性内切酶图谱的研究.pdfVIP

第2卷 第2 中围 实验 动 物 学 摄 维普资讯 J9§4年。t月 工ctLnboraI。rilAni≈L．IisscjⅡtlasi1·j∞ CAR-bacillus菌亚单位核糖棱 RNA限制性 内切酶图谱的研究 魏 强 过正义 石原智明 伊藤丰志堆 (中目基学科学妻骞验动钫研究所．北京) 摘要 利用生物休中编码亚单 棱精棱[~RNA (smallsubunitribosorealRNA，qSU rRNA)的DNA序列为引钫，经PCR法扩增到CR—bacillusgrJ天约1．3kb的SSUrRNA；F 列．采]~HindⅡ，HinfI．EcoTI4．Hae瑾和xh0I菩5种熙制性内切酶进行酶 电浓 }析．同 时比较了来源：Pel,~1的CBM株及来源于太鼠的CBR株，束发现两者有差异。 关键词 CAR—bacillus 亚单＆rRNA 限制性由切酶圈谱 Cilia—AssoclatedRespiratorybuelllus(CAR-bacillus)是近来发现的引起小鼠、大 鼠 兔等实验动物呼吸系统痰病的病原菌，但其束技成功培算，故其分类及生物学特征尚未 完垒弄清 【l|。CAR—bacillus只鸵在鸡胚胎的尿囊腔中生长传代，日本学者近两年 ：在人工 培养基中试图成功培养CAR-baeillus，但进展不太，现有的交叉感染实验也不能充分说明 CAR—bacillus的宿主性 (2—4)。为了啦确不同采源的CAR—bacillus之间妁差异，我们采用 了近年来非常受重视@,JrRNA基因分析法进行限制性内韧酶酶切电泳分析，以琏了解它们之 间的差异。亚单位rRNA即16SrRNA基困在所有微生物中都存在非常高膨均保守区片段，且 基因长度大约在1．5kb左右，利于测序．故在了解生物进化，基因分型及枇属浆定方而倍受 关注(，尤其是对未能培养的微生物曲遗传背景的了解嚣常重要。 材料与方法 ICAR—bacillus菌 CBM和CBR株分则来自发病的小鼠及大鼠．分离接种鸡胚尿囊 腔传代数次后，收集备用。 2 基因组DNA的制备 收集上述菌液各imi，充分离心沉淀菌渣后，悬浮于0．5ml10 mMTris—HC1液中，经l0师SDS和3O12mg／ml蛋白酶K消化1h，酚抽提3次．酒精沉淀抽 干后倍于0．5m1TE缓冲液中。 3用PCR法扩增SSUrRNA基因依据真细菌属SSUrRNA基困两端像守区，合成引物， 序列分别是5AGAGTTGATGCATGGCTC3和5AAGTCGTAACAAGOJTAACCa， 浓赛为10M，dNTP为10mM，20l的反应系统中基因组DNA模板2l，10mM dNTP2 1，10xTTHbuffer2l，日l物各0．5vt1．dH：OI3l，加入TTH(4单位／1TOYOBO) 0．3l，变性温度为93℃时问40s，复性37℃1os，殛伸72℃2rain，总共进行30个热循环 1 日本酷农学园大学实验动物研究宣 2 日本实量盘动物中央研究所 H 目 女 w jK 维普资讯 (PC一700DNA热循环仪)。PCR产物用乙醚除油，酒精沉淀后，溶T20MTE缓冲液中· 4 限制性内切酶消化 J~HindⅢ，HneI EcoT 、HaeⅡ和Xh。I等5种限制性内 切酶充分消化4h。 5 电泳分析 用L．5和琼瞪糖凝胶，电泳液为howly缓冲披，电畦150V电流l20mAt时 间 ，以Pun19／Hin￡Idigest为分予量参照．分析酶切片段 结 果 CAR—bacillus的SSUrRNA分子量约为1．5kb，HindⅢ不能消化，Hin[I有两个片 段，EcoT14有两个片段，HeaⅢ有3个，xhoI有两个。从结果看出，CBM和CBR的限制性 内切图谱完全一样，其PCR产物的分子量也完全一致，这表明不同种属动物(大鼠和小鼠) 来源的cAR—bacillus．其遗传背景和分化是一致的：