[农学]荧光定量PCR.pptVIP

目录 一、背景知识 二、什么是定量PCR 三、荧光定量PCR的基本原理 四、定量PCR定量的理论依据 五、荧光定量PCR定量的理论模式 六、定量PCR的分类 七、传统的定量PCR的难点 八、荧光定量PCR的优点 九、怎样设计荧光定量PCR实验方案 十、荧光定量PCR 技术在科研中的应用 一、背景知识 1、1985 年，美国Perkin-Elmer Cetus 公司人类遗传研究室Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR），使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，但是，利用传统的PCR 技术进行检测鉴定时，需要进行扩增反应后的电泳分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制。 2、1992 年，Higuchi最早提出了实时PCR 的设想，它的基本思想是利用荧光染料EB（溴化乙锭）可以插入到双链核酸中受激发光的性质，在PCR 反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB 的含量就能实时监控PCR 反应的进程，根据PCR 反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi 利用的是嵌入荧光染料检测，它只能简单地反映PCR 反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。 （陈旭等，2010） 3、到1995 年，美国PE 公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR 技术，融合了PCR 高灵敏性、DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR 过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增产物定量的结果，不需要PCR 后处理或电泳检测，完全闭管操作（整个过程中仅有加入样品的一次开盖），一举克服了常规PCR 技术的诸多难题。 （陈旭等，2010） 二、什么是定量PCR 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样品中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 三、荧光定量PCR的基本原理 （1）在荧光定量PCR 反应中， 引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化。从而得到一条荧光扩增曲线。（朱捷等，2009） （2）、荧光扩增曲线包括3 个阶段：基线期，扩增期和平台期。只有在荧光信号扩增期，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以可以在这个阶段进行定量分析。（朱捷等，2009） （3）、为了便于对所检测样本进行比较，在荧光定量PCR 反应的指数期，需要设定一定荧光信号的阈值，一般这个阈值是以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本地信号， 荧光阈值的缺省设置是3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。 （朱捷等，2009） （4）、如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号，它可以用于定义样本的阈值循环数（Cycle Threshold，Ct）。每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数存在线性关系。在PCR 过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到荧光阈值时，Ct 值被记录下来。（朱捷等，2009） （5）、起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct 值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 （朱捷等，2009） 四、定量PCR定量的理论依据 （1）、特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。 （2）、理想的扩增结果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体系中的原始模板数，n为扩增次数。 （3）、理论上PCR扩增效率为100%，PCR随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为： Y=X×(1+E)n，其中E代表扩增效率：E=参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1~105拷贝、循环次数n ≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数的增加，E值逐渐减少，Y呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。 五、荧光定量PCR定量的理论模 式