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紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 它是利用物质的分子或离子对200-800nm光谱区内辐射能的吸收，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。 精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？ 同一物质，当浓度相同时，吸收曲线是重叠的。同一物质，不同浓度时，吸收曲线的形状不变，最大吸收峰位置不变，仅是峰高改变。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。 1，???*跃迁 它需要的能量较高，一般发生在真空紫外光区。饱和烃中的—c—c—键属于这类跃迁，例如乙烷的最大吸收波长?max为135nm。 2，n??*跃迁 实现这类跃迁所需要的能量较高，其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区，如CH3OH和CH3NH2的n??*跃迁光谱分别为183nm和213nm。 3，???*跃迁 它需要的能量低于???*跃迁，吸收峰一般处于近紫外光区，在200 nm左右，其特征是摩尔吸光系数大，一般?max?104，为强吸收带。如乙烯（蒸气）的最大吸收波长?max为162 nm。 ?max= 104 共轭键愈长所需能量愈小. 4，n??*跃迁 这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100. 共轭键愈长所需能量愈小 某些常见生色团的吸收光谱 选择溶剂时注意如下几点： （a）尽量选用低极性溶剂； （b）能很好的溶解被测物，并且形成的溶液 具有良好的化学和光化学稳定性； （c）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 (3) pH值 pH值对酸碱物质有明显的影响，因pH值不同，化合物解离程度不同，产生的光谱也不同。 第二节 基本原理 一、Lamber-Beer定律 二、吸光系数和吸收光谱 三、偏离Beer定律的因素 四、透光率的测量误差 三、偏离Beer定律的因素 依据Beer定律，A与C关系应为 经过原点的直线 偏离Beer定律的主要因素表现为 以下两个方面 （一）光学因素 （二）化学因素 （一）光学因素 1．非单色光的影响： Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光 续前 续前 讨论： 入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状 结论： 选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑） 选λmax作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性） 续前 2．杂散光的影响： 杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度 范围内，与所选波长相距较远 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成 杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值 3．反射光和散色光的影响： 反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光 直接对T产生影响 散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形 注：一般可用空白对比校正消除 4．非平行光的影响： 使光程↑，A↑，吸收光谱变形 （二）化学因素 Beer定律适用的另一个前提：稀溶液 浓度过高会使C与A关系偏离定律 四、透光率的测量误差——ΔT 要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极小值，得出： lgT=-0.4343=A即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小 影响测定结果的相对误差两个因素： T和ΔT ΔT影响因素：仪器噪音 1）暗噪音 2）讯号噪音 续前 1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关 与光讯号无关 2）讯号噪音——与光讯号有关 第四节 紫外分光光度计 1．光源： 2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件 续前 3．吸收池： 玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区 石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致） 4．检测器：将光信号转变为电信号的装置 5．记录装置：讯号处理和显示系统 类型： 1．单光束分光光度计： 特点： 使用时来回拉动吸收池 →移动误差 比色池配对 续前 2．双光束分光光度计： 特点： 不用拉动吸收池，可以减小移动误差 可以自动扫描吸收光谱 续前 3．双波长分光光度计 特点： 利用吸光度差值定量 消除干扰和吸收池不匹配引起的误差 3、吸光系数法 利用标准的吸光系数值进行定量。