[医学]药物定量分析与分析方法验证.pptVIP

内标法： 对内标物要求： a．内标物须为原样品中不含组分 b．内标物与待测物保留时间应接近且R1.5 c．内标物为高纯度物质，或含量已知物质 内标法优点： 进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响 只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 适合测定微量组分 内标法缺点： 制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子 ③ 加入强酸 常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、 5%偏磷酸等 试剂用量 ——血清与强酸的比例为1∶0.6时 ——除去90%以上的蛋白质 离心分离 ——高速(10000r/min)离心1~2min 上清液pH ——pH 0~4 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 ④ 加入含锌盐及铜盐的沉淀试剂 当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀。 常用的沉淀剂 —— CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等 血清与沉淀剂的比例——1∶(1~3)，90%以上 离心分离——高速(10000r/min)离心1~2min 上清液pH——分别为5.7~7.3和6.5~7.5 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 ⑤ 酶解法 加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。 最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.0~11.0)内使蛋白的肽键降解，在50~60℃具有最大活力 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 （２）缀合物的水解（自学 ） 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 （3）分离、纯化与浓集 目的：a—消除内源性物质、代谢物及其他共存 物质的干扰； b—提取浓缩待测物质，使其易于检测 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 ——液—液萃取法(传统的方法) ——固相萃取法(液—固萃取法) ——自动化固相萃取技术 ——固相微萃取 ——膜萃取技术 ——微透析技术 ——超临界流体萃取法 方法： （3）分离、纯化与浓集 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 A：溶剂的选择——试验成功的主要条件 ——相似相溶的原则 ——对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶 ——沸点低、易挥散，毒性小 ——与水不相混溶 ——具有较高的化学稳定性和惰性 　① 液—液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE) 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 萃取次数——通常为1次(萃取R在70%以上) ——必要时2~3次(萃取R在50%以下) 每次用量——和水相的体积比通常为1:1或2~5:1 萃取方式——分液漏斗或涡流混合 B：萃取方法 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 C：水相pH值 水相pH值——药物的pKa确定——90%以上的非电离形式 碱性药物最佳pH值：高于pKa值1~2个 pH单位 酸性药物最佳pH值：低于pKa值1~2个pH单位 一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值 介质中提取； 生物样品宜在碱性或近中性提取——生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 pH = 13 pH = 7 pH = 2 空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 2. 固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE） ① SPE原理——将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。 第三节 生物样品分析 方法的基本要求 ② 洗脱方式—— A: 药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一 种对药物亲和力更强的溶剂洗脱 B: 杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱 通常为A模式，前应用最广泛的微型柱——Bond Elut（美国Analytichem International公司）和Sep-pak微型柱（美国Waters公司） 第三节 生物样品分析 方法的