[生物学]蛋白质的共价结构.ppt

3.4 蛋白质的共价结构 纯化一种蛋白质仅仅是研究其结构和功能等详细生化性质的序曲。不同的蛋白质最明显的差别就是他们有不同的结构。一级结构的差别尤其富含信息。每种蛋白质有不同的氨基酸残基种类和数量。蛋白质的一级结构决定着它如何折叠成独特的三维结构，而结构有决定着蛋白质的功能。 氨基酸序列决定蛋白质功能 每种蛋白质都有独特的三维结构，形成独特的功能，每种蛋白质也各有特殊的氨基酸序列。通过对不同蛋白质的氨基酸序列测定，对人类遗传疾病的跟踪研究，并且在比对了不同物种间功能相似的蛋白质之后，我们可以大致得出结论——氨基酸序列决定蛋白质的功能。 氨基酸序列决定蛋白质功能 对于一个特定蛋白质，其氨基酸序列也不是绝对固定不变的。大约20%~30%的人类蛋白质是多态的。这些变动大多数对蛋白质功能没有影响或影响很小。而且关系较远的物种间执行相似功能的蛋白质在大小和氨基酸序列上可能差异很大。 在蛋白质的氨基酸序列中常常有关键区域，直接影响其功能，而其他区域的氨基酸序列可以有很大变动，且不影响其功能。关键区域在不同蛋白质间互不相同，使得联系序列与三维结构、机构与功能之间关系的任务变得复杂。 众多蛋白质的氨基酸序列已被测定 短肽测序自动化 分析蛋白质的一级结构有多种方法。如水解蛋白质并测定器氨基酸组分，由于蛋白质之间氨基酸组分不同，他可以作为一种指纹图谱来鉴定不同实验室分离的蛋白质是否相同，但不能确定蛋白质的氨基酸序列标记和测定末端氨基酸残基是与蛋白质水解常连用的方法。 氨基酸残基测定方法 (2)丹磺酰氯法（DNS法） Dansyl-Cl法灵敏度是FDNB 法的100倍 反应： Dansyl-Cl + Pr-NH2 PH 9.5~10.5 DNS-Pr 酸水解 DNS-aa + aa （0.1~1ng) 37?，1hr 乙酸乙酯 聚酰胺薄膜层析 A254nm 黄色荧光 抽提 A365nm 副反应： Dansyl-Cl过量时生成DNS-NH2 （绿色荧光）和DNS-OH 部分DNS-aa酸解后破坏，破坏率： DNS-Pro（77%）； DNS-Ser （35%）； DNS-Gly（18%）； DNS-Ala （7%） 氨基酸残基测定方法 （4）氨肽酶法 Pr-NH2 氨肽酶逐一内切 游离aa 氨肽酶种类： 优点: 可连续测定N-端多个aa；条件温和 缺点：酶反应通常是可逆的，水解不彻底； 酶对末端aa的反应性不同，而导致判断失误 氨基酸残基测定方法 （2）羧肽酶法 从C-末端逐一向内水解，产物为游离aa 多肽链的测序一般步骤 多肽链的测序一般步骤 （a）测定氨基酸组分 （b）测定氨基酸残基。上图显示的是Sanger法 （c）利用Edman降解法获得整个序列。对于短肽，单独使用此法即可得到完整结果，从而省去了（a）（b）步骤。对于测定长肽链，则先要断裂并分离短片段在进行测序。 多肽链内的半胱氨酸残基之间的二硫键断裂 由于二硫键干扰多肽酶促裂解以及步骤六和Edmam法测序步骤，因此需要将多肽链内的半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 多肽链内的半胱氨酸残基之间的二硫键断裂 蛋白质分析中胱氨酸残基的二硫键可用氧化剂或还原剂打开。过甲酸可定量打开胱氨酸二硫键生成硫基丙氨酸。具有巯基（R—SH）也能断裂二硫键，生成半胱氨酸及相应二硫化物。 因此再打开二硫键时可采用巯基以纯和二硫苏糖醇，同时还需要假如卤代烷与巯基反应进行保护，防止再次被氧化。 肽段的测序和降解 有几种方法可以使肽段片段化，蛋白酶可以催化肽键的水解。一些化学试剂也能在特殊位置切开肽键。 肽段的测序和降解~Edman化学降解法 Edman 发表了一种聚肽的顺序切割法。末端胺基酸的移除，是经两个步骤完成的。首先，在pH 8 下，以异硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate) 处理，使末端胺基酸转变为硫胺基碳酸苯的衍生物。第二步是PTC- 用无水的三氟醋酸(trifluoroacetic acid) 处理，催化末端胺基酸环化为Anilino-thiazolinone 的衍生物。 以Edman 切割法逐步移除的胺基酸都被鉴定后，聚肽胺基酸顺序就被建立了。移除的胺基酸，可用环状衍生物直接测定。 由于目前Edman化学降解发效率较低，因此需要将长的多肽链裂解为较小的肽段，才能进行测序。 定位二硫键 由DNA片段推