DNA的琼脂糖凝胶电泳简介琼脂糖凝胶电泳对核酸的.pdf

中国试剂网 3.16.1.4 DNA 的琼脂糖凝胶电泳简介 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构 型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 （1）DNA 分子的大小 在凝胶中，DNA 片段迁移距离 （迁移率）与碱基对的对 数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比 较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA 分子大小超过20kb 时，普通琼脂 糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用 琼脂糖凝胶电泳分离DNA 时，分子大小不宜超过此值。 （2 ）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA 需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离。 表 琼脂糖浓度与DNA 分离范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA 大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1 2 、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA 的移动速度次序为：供价闭环DNA （covalently closed circular， cccDNA ）直线DNA开环的双链环状DNA 。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA （一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0 （Rm=0 ），而同等大小的直线双 链 DNA （刚性棒状）则可以长轴方向前进 （Rm0 ），由此可见，这三种构型的 相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等 的影响。 3、电泳方法 （1）凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型 （平板型）。水平型电 泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下 1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用 的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需 要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。 中国试剂网 3.16.1.4 （2 ）缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA 迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流 太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA 的变性。 常用的电泳缓冲液有EDTA （pH8.0 ）和Tris- 乙酸 （TEA ），Tris-硼酸 （TBE ）或 Tris-磷酸 （TPE ）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8) 。电泳缓冲液一般都配制成 浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 TAE 缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE 浓溶液长 期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5 ×溶液，用时稀释10 倍0.5 × 工作溶液即能提供足够缓冲能力。 （3 ）凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水 平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。 （4 ）样品配制与加样 DNA 样品用适量 Tris-EDTA 缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他 指示染料，含有 10%-15%蔗糖或 5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。 为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U 形条带，可改用2.5%Ficoll （聚蔗糖） 代替蔗糖或甘油。 （5 ）电泳 琼脂糖凝胶分离大分子DNA 实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下， 分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈 正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA 片段迁移率的增