ECL化学发光试剂.pdf

LumiPico® ECL Kits User Manual ShineGene LumiPico® ECL Kit User Manual For Western Blot Cat.Nos.ZK00901(12.5ml ×2) ￥200.00 ZK00902(50.0ml ×2) ￥800.00 Published 24 Feb 2007 Tel ：+86-21-5446 0832 E-mail:master@ website ： LumiPico® ECL Kits User Manual ShineGene 超敏化学发光试剂(LumiPico® ECL Reagent) 一、用途： 本试剂是非放射性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达 1-5pg。用X 光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持 12 小时以上的发光，便于 反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或 核酸检测。特别节省抗体(一抗 1:500-1:5000，二抗 1:3000-1:10000)。 二、原理： 辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得 发光增强了 1000 倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经 SDS分离，并转移到 固相膜上（如 NC、PVDF）等，用于免疫学检测，经 HRP 标记的抗体与膜上的蛋白直接 （标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol 发生氧 化降解，并发射波长为 428nm 的光，此光可经X 光胶片(放射自显影片)感光记录下来。 三、使用方法： 1. 印迹膜制备 按常规方法完成 SDS和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通 过标记一抗或二抗的手段引入 HRP，一般采用市售的 HRP 二抗交联物。仔细地淋洗对于 降低背景非常重要，在与 HRP 交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完 成。 2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合 A 液和 B 液，混合后尽快使用。将膜片置混合 液中于室温下振荡温育 2 分钟，每平方厘米膜片至少使用 0.1-0.2ml 以覆盖全膜片。 3.蛋白信号显现 1). 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。 2). 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。 3). 将膜片吸附蛋白面朝上，置于 X 光片盒中。 Tel ：+86-21-5446 0832 E-mail:master@ website ： LumiPico® ECL Kits User Manual ShineGene 4). 于暗室中压上 X 光片。 5).根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或5min，也可选择不同时间多次压片， 以达最佳效果。显影冲洗。 6). 调节曝光时间，再次曝光显影。 4、膜的重复使用： 配置 62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml 的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70?C 振 荡水浴 30 分钟。再用 TBST 或 PBST 缓冲液洗脱，最后用 BSA （牛血清白蛋白）或牛奶 封闭。 四、操作注意： 1. 本试剂每个批号均独立优化，请不要混用或稀释本试剂以免降低敏感性； 2. 加入一抗后膜不能再干燥； 3. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要； 4. 使用前配置化学发光试剂，配置足够覆盖膜片即可，弃去使用过的混合试剂； 5. 使用干净取样头取用每种试剂； 6. 第一张片子建议曝光 1