第一部分：分子克隆技术.pptVIP

puc19 pu1301 PU1301+1.5KB外源 双酶切： BamHI+KpnI 实验步骤： 将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上； 调整好梳子的高度； 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶； 凝胶凝固后，小心拔去梳子 将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中； 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）； 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 μg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 1. 含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中 2. 含有电泳指示剂，以指示电泳的进程 上样缓冲液： EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000×贮存液(0.5mg/mL )，使用时按1：1000稀释配制染色液。 质粒电泳检测： 一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型） 超螺旋 开环 线型 质粒电泳检测 2005年春季2002生技质粒图片 质粒载体的抽提，外源DNA的准备 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量 载体与外源DNA的限制性内切酶消化 (载体的去磷酸化) 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子的转化及筛选、鉴定 利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤 载体及外源片段的限制酶消化: 限制性内切酶切出相互匹配的粘性末端（一种酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端； 载体的去磷酸化: 碱性磷酸酶去除载体的5’－P基团，以防载体自连； 线状载体与外源片段的连接: 连接酶使双链DNA 5’－P与相邻的3’－OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5’磷酸基团， 则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。 不同酶切的平头可连接 非重组克隆的背景高 质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失（不同平端酶） 重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝 要求较高的DNA及连接酶 末端为平端 一般酶切位点常可保留 外源DNA会以两个方向插入 重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝 线状质粒DNA常需用磷酸酶（CIP）处理 相同的突出端 一般酶切位点可保留, 非重组克隆背景低 不需CIP处理 外源DNA只以一个方向插入重组质粒中 用两种限制酶消化后需纯化质粒以提高连接效率 不同的突出端 特点 克隆的要求 外源DNA 不同末端克隆的要求及特点 限制性内切酶 碱性磷酸酶 连接酶 几种工具酶 有特定的识别序列 ，通常为4－6碱基的回文对称序列。 切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基团，3’末端有羟基。 切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)两种 其活性发挥只需Mg2＋作辅酶。 II类限制性内切酶的特点 限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50μl 反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1 μg 的DNA完全分解所需要的酶量。 限制酶的star活性：限制酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。 高浓度的甘油（5％）； 酶过量（100U/ug）； 低离子强度（25mM）； 高pH(pH8.0)； 有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺； 用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+) 不同的酶对上述因素的敏感程度不同 引起星星活性的主要因素： 氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） 牛血清白蛋白（BSA） 典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括： BamH I： G▼GATT C C CTAA▲G Kpn I: G GTAC▼C C▲CATG G 含外源DNA片段的载体 （50 ?l反应体系，用1.5ml tube，冰上操作） DNA 35 ?l BamH I (10u/μl) 1 ?l Kpn I (10u/μl) 1 ?l 10×b