PCR基本原理及注意事项教材教学课件.pptVIP

PCR基本原理及注意事项 目录 基本原理 常见问题 反应体系 基本原理： 变性 延伸 退火 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 反应体系 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 　 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2 加双或三蒸水至 10ul200umol/L 各10～100pmol　 0.1～2ug 2.5u　 1.5mmol/L100ul 引物 酶 dNTP 模板 Mg2 五要素 PCR反应 有或能加上合适的酶切位点 与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物3’端的碱基严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基 G C含量以40-60%为宜 ATGC随机分布 避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补 扩增跨度 以200-500bp为宜 15-30bp 引物 设计 酶及其浓度 栖热水生杆菌 天然酶 大肠菌合成