[生物学]电镜超薄切片1.pptVIP

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[生物学]电镜超薄切片1

透射电子显微镜生物制品制备技术 组织学与胚胎学教研室:苏衍萍 冰冻蚀刻复型术 Freeze etch replica 冰冻割断术 电镜细胞化学术 Freeze cracking electron microscope cytochemistry 免疫组织化学技术 免疫电镜术 Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy 电镜放射自显影术 显微放射自显影技术 Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography 扫描电镜技术 Scanning electron microscopy SEM 现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类: 一类是透射电镜的基本制备技术,包括超薄切片和负染色法; 另一类是生物制品的特殊技术,其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术 、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。 1、????? 超薄切片样品的制备 (1)?? 取材( 基本要求是在活体情况下进行) 取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则) 1)? 快速:1分钟之内投入固定液。 2)?? 块小:0.5-1mm3或截面1mm2的长条。 3)?? 部位准 4)? 损伤小:器械应锐利,避免牵拉、挤压,防止组织受机械损伤。 5)??? 低温:0-4oC 取材的方法 1)动物材料: 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定,待组织适当硬化后再取材。 2)培养细胞(Cell culture): 生长在瓶中的细胞到足够的量,先倒去培养液,然后倒入适量的戊二醛固定液,在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞,将这种混合液倒入离心管中,2000rpm低速离心15-20分钟,使细胞呈团,弃去上清液,换一次固定液,将其移入修块台,修快成标准块4oC固定、待用。 3)单细胞悬液:精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料,可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液,轻轻地把他们悬浮在固定液中。 经过固定处理后 再离心成团, 在50oC中弃去上清液, 加入适量的经50oC 预温的2%的琼浆, 使团悬浮,将悬浮团 和琼脂液一同在薄片 上展层,固定后 切成1mm3的小块。 (2)固定 (fixation) The aim is to avoid digestion by enzymes (autolysis) or bacteria and to preserve the physical structure, pieces of organs should be promptly and adequately treated before or as soon as possible after removal from the animal’s body. 1)Function of fixation A.阻止细胞自溶。 B 稳定细胞物质成分。 C 在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链,提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。 D能提供一定的电子反差 理想的固定剂,应具备以下条件:①能迅速而均匀地渗入组织细胞内部,稳定细胞内各种成分;②能即刻将细胞“杀死”,尽可能保持细胞微细结构,减少死后变化;③对细胞不产生收缩及膨胀作用,不产生人工假象及变形;④可保存酶的活性,以利于细胞化学测定工作的进行。 2)影响固定效果的因素 ①固定液的pH值 ②渗透压 ③缓冲液的类型 ④固定的温度和时间 当前采用的是在0~4℃下固定1 ~ 4小时。 3)常用的几种固定剂 A 四氧化锇(osmium tetroxide,OsO4)亦称锇酸:锇酸实际上不是酸,它的水溶液是中性的,为一种强氧化剂。0.5-1g包装,淡黄色晶体。具有挥发性和毒性,在室温下易挥发,其蒸气对粘膜有刺激作用,在通风橱内配制。 ?优点①对蛋白质、磷酸脂蛋白、核蛋白固定较好; ②对脂类固定较好。③分子密度高,产生良好的反差,因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。 缺点①不能固定糖元和核酸,对微管固定较差。②扩散慢,穿透能力差。③具有挥发性和粘膜毒性。④不适于进行细胞化学工作。 B戊二醛(glutaraldehyde,C5H8O2) 特点:纯的容易聚合,目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质,影响固定。 优点 (1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性,对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液

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