[高三理化生]血红蛋白的提取与分离cr2011-12-21.pptVIP

(一)蛋白质分离和提取的原理 一.基础知识 根据蛋白质各种特性的差异： 分子的形状、大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 对其他分子亲和力 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、空间结构 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白 （二）蛋白质提取和分离的方法 凝胶色谱法：又称分配色谱法 电泳法 1.凝胶色谱法 2）材料：凝胶 (分配色谱法) 1）概念 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。 3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 2.电泳 1)概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 2)原理 利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3)类型: 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳 4)实例： SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 用途: 测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度 原理： SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。 讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 (三)缓冲溶液 抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变 1.作用 2.配制 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4 说出人体血液中缓冲液? 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 二.实验操作 血液组成 (1)红细胞的洗涤 (2)血红蛋白的释放 (3)分离血红蛋白溶液 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 透析除去分子较小的杂质 通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 三.实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 完成步步高P261页 对位训练6、7 P261页 考题链接(考题2) P262页 易错警示 血液组成成分 阅读思考： 血液由______和________两部分组成。 血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。 该化合物是由 _____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。 血浆 血细胞 红细胞 血红蛋白 2条α-肽链 2条β-肽链 亚铁血红素 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白 选材 1.洗涤红细胞 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍