总RNA的提取和RT-PCR教材教学课件.ppt

实 验 总RNA的提取与RT-PCR 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 /sfzx/ 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法 目 的 实 验 流 程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA 合成cDNA 第一链 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 第一部分 细胞总RNA的提取 操作步骤 1.匀浆化作用 8000rpm 离心2min收集细胞，弃上清；加入500uL的TRIpure,用振荡器震荡至无明显沉淀,室温静置5min. 2. 分离阶段 向匀浆样品中加入0.1mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育2-3min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。 3. RNA的沉淀 向上清中加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min， 12000g离心10min，弃去上清液，可见胶状沉淀。 4. RNA的漂洗 加500微升75％乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤， 12000g离心5min,弃去乙醇. 5. RNA的再溶解 空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uL RNase-Free处理水，充分溶解。 原 理 10-5mg RNA/细胞 mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 原 理：Trizol的主要成分 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 原 理 RNA酶污染来源 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 防止RNA酶污染的措施 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 RNA完整性检测 完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。 RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻。 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.细胞在用胰酶处理时过度。 D.溶液或离心管未经RNase去除处理。 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。 DNA污染 A.样品匀浆时加的试剂量太少 B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液 常见问题分析 第二部分逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 仪器和主要试剂 基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 总RNA 第一链cDNA合成试剂盒 （含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液） dNTP