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His Tag 融合蛋白纯化操作手册 宝泰克生物科技公司 分子生物学
产品使用说明书
His ·Tag 融合蛋白纯化操作手册
采用pET 系统进行原核蛋白表达,蛋白的表达量达到20mg/100ml 培养物并不是困难的事。
在大肠杆菌中表达的目的蛋白,其可溶性(可溶蛋白或包涵体)、细胞定位(细胞质、细胞周
质、培养基上清),都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后,首先进
行目的蛋白的细胞定位(请参考pET 系统操作手册);在进行大量纯化之前,小量纯化蛋
白,摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件,也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表
达,可能以可溶形式存在,也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下,更容易形
成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系,可以
通过选择不同表达载体和E.coli 宿主菌组合,摸索生长条件和适宜诱导条件,达到优化蛋白表
达的目的。His·Tag®融合蛋白,可以在天然条件或变性条件下用NTA His·Bind 树脂或IDA
His·Bind 树脂进行纯化。
内容提要
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
2. 细菌裂解获得可溶蛋白
• BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法
• 机械破碎(如超声等)
二、亲和纯化步骤
(一)IDA HisBind 树脂纯化
1. 散装树脂亲和纯化
• 天然条件柱层析
• 天然条件批次小量纯化
• 变性条件的纯化
2. 其它常见IDA 树脂产品形式的纯化
• IDA His·Bind 预装柱纯化
• IDA His·Bind Quick 柱和筒纯化
• His·MagTM 琼脂糖磁珠纯化
3. 洗脱之后的样品处理
附录:补充背景知识
• NTA 和IDA 化学基团 • 杂蛋白
• His·Bind 基质选择指南 • 如何降低非特异性结合
• 在确定裂解方法前的考虑 • 漂洗杂蛋白
• 蛋白可溶性及细胞定位 • 目的蛋白的洗脱
• 天然或变性条件下目的蛋白的纯化 • 纯化真核表达体系来源的His·Tag 融合蛋白
• 批次小量纯化或柱层析纯化方法 • His·Tag 融合标签的去除
• 目的蛋白的结合 • 推荐资料
默克生命科学服务热线:400 820 8872
bioteam@
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素,包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达,需要采
用一个较高的浓缩系数(concentration factor )进行菌的裂解,即在较大培养体系中,按一定比例加入一定体积
的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的
裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小,请参考表1。
例如,某蛋白表达水平约为0.1mg/ml,需要在变性条件下进行小批提纯,则100ml 的培养物离心获得的菌体,
按浓缩100 倍比例重悬于含变性剂的1ml 裂解/结合缓冲液中。
在非变性条件下进行纯化时,要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难,一般建议采用50-100 倍浓缩。
表1 确定所需菌液体积
His·Tag 融合蛋白浓度 表达水平 培养体积 His·Tag 融合 浓缩系数
蛋白总量 (在1ml 溶液中裂解后)
变性条件
50mg/L 40% 3ml 150µg 3 ×
10mg/L 8% 10ml 100µg 10×
2mg/ L 1.6% 25ml 50µg 25 ×
0.5mg/ L
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