拟南芥硫腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因samdc-石河子大学.doc

编号: SRP2012274 　　　　　　　　　　　　　 石河子大学 项目研究进展报告 项目名称 拟南芥硫腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（SAMDC）转化棉花提高抗逆性的研究 负 责 人 李同花 小 组 成 员 吕蒙、赵云 所在院系 农学院农学系 专业班级 10级2班 指导教师 朱华国 副教授 填表日期 2012.10.9 石河子大学教务处  拟南芥硫腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（SAMDC） 提高棉花抗性的研究 项目研究意义 多胺广泛存在于所有生物中, 并且在细胞生长发育衰亡过程中起重要的作用。在多胺的生物合成途径中腺苷甲硫氨酸脱羧酶 (S-adenosylmethioninedecarboxylase, SAMDC)是一个关键的调节酶， 在植物形态发生、胚胎发生和早期果实发育过程中具有很强的调节作用。SAMDC 催化腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)形成的脱羧 SAM，它为多胺生物合成提供氨丙基供体。大量研究表明，植物 SAMDC 基因主要是通过调控植物体内多胺的含量来影响植物应答环境胁迫。因此对 SAMDC 的特征及调节作用进行研究有很大的现实意义。 通过查阅文献，了解到多胺在菜豆、苜蓿、小麦、西葫芦、枸杞、苹果树等植物的研究中应用广泛，主要表现为提高植物（再生能力弱的谷类）在渗透胁迫下的抗逆性；低温胁迫下的抗逆性（多胺结合到细胞膜的磷脂部位, 防止胞溶作用, 提高抗冷性）；盐胁迫下的抗逆性（如多胺对玉米的盐毒害有缓解作用）；酸胁迫下的抗逆性（酸胁迫可增加植物某些系统的Put水平和ADC活性，促进多胺的生物合成和积累）。 新疆棉花生产等特点著称全国棉花在农业总产值中的比重超过60%，其形成的工业增加值已超过30%㈠AtSAMDC超表达载体构建 1、加接头引物的PCR扩增 2、BP反应→热击转化→涂平皿→挑单克隆、摇菌 3、PCR验证→跑电泳→阳性克隆→提质粒 4、LR反应→热击转化→涂平皿→挑单克隆、摇菌 5、PCR验证→跑电泳→阳性克隆→提质粒→酶切验证→阳性质粒→电击转化农杆菌→挑单克隆→摇菌、涂平皿→转导用 1、PCR扩增 (20ul体系) 试剂 加入量 模板（DNA） 0.5ul 正向引物 1ul 反向引物 1ul 10×PCR buffer 2ul dNTP 2ul Taq DNA聚合酶 0.3ul dd H2O 13.2ul 注：质粒cDNA0.5ul, 菌液2ul；最后加石蜡油10ul防止挥发。 反应程序： ① 94℃ 5min ② 94℃ 30s 循环29次 ③ 56℃ 30s ④ 72℃ 1min30s ⑤ 72℃ 10min （跑琼脂糖电泳PCR产物检测： 1)、 琼脂糖胶：琼脂糖+电泳缓冲液 2)、微波炉煮沸至澄清稍冷倒板 3)、小心吸取EB(小板3ul，大板5ul)用枪头搅匀并选取适当的梳子待冷却凝固 4)、吸取PCR产物点样，以Marker I、II 、III作参照，跑电泳检测样品长度是否符合） 2、BP反应 试剂 加入量 PCR product 2ul Salt solution 1ul Water 2ul Topo vector 1ul 3、热击转化（电击转化） 4、提质粒 使用生物公司定制的试剂盒提取质粒 5、LR反应及产物的热击转化 6、5步骤菌涂板挑单克隆及PCR验证 7、酶切验证电击转化农杆菌（挑单克隆获得菌液留转导用） ㈡、无菌苗培养： 把棉籽（彩棉7号、Y1）剥去种皮，在超净工作台上用0.1%HgCl2消毒10 min ，再用灭菌的去离子水冲洗3次，彻底洗去残留的HgCl2。将种仁接种在无菌苗培养基上（附表1），每瓶种4-5棵苗（注意尽量放的时候分开放，防止污染），28℃暗培养5-6天（暗培养2-