1、细菌的形态结构观察和染色PPT.ppt

实 验 一 细菌的形态结构观察和染色 目的要求 观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。 安全事项 微生物 酒精灯 灭菌锅 玻璃器皿 超净台（紫外线） 电器（电炉、微波炉…） …… 奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜 镜筒 物镜转换器 载物台 载物台调节钮 粗调节器 细调节器 电源 光强调节钮 孔径光阑 视场光阑 双筒目镜 摄像头 物镜 镜座 镜臂 荧光发射装置 奥林帕斯生物显微镜的使用方法 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 用低倍物镜，旋转粗调和微调来进行对焦。 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看清物象为止。 换片：另换新片，必须从第9条开始操作。 观察完毕，下降载物台，取下载物台上的载玻片，将4×的目镜对准载物台，再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。 用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关闭主开关，切断电源。 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。 若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物像更加清晰。 基本原理 (一) 简单染色法原理 (二) 革兰氏染色法原理 (三) 抗酸染色原理 (四) 芽孢染色原理 (五) 荚膜染色原理 (六) 鞭毛染色原理 染色剂和染色原理 微生物染色常用染料如下表： 实验内容（简单染色的方法和步骤） 涂片 自然干燥 微火固定 染色l min 冲洗 吸干 镜检 实验内容（革兰氏染色的方法和步骤） 涂片，干燥、固定 草酸铵结晶紫染液染色lmin，用水冲洗 用革氏碘液媒染lmin，用水冲去碘液 用95％乙醇脱色10-30s，至乙醇液不呈现紫色 蕃红染液复染lmin，用水冲洗 吸干并镜检 实验内容（了解抗酸染色的方法和步骤） 1．制片 将少量草分枝杆菌制成菌悬液，80℃恒温水浴3h杀死菌体。取菌悬液涂片，自然干燥。 2．染色 滴加石炭酸复红染液2滴，覆盖涂片，在微火上加热至有蒸气出现，不断补充染液，加热8～10min，弃染液。 3．脱色 用3％盐酸乙醇液脱色，至乙醇液呈淡红色或无色。 4．水洗 滴加蒸馏水洗去盐酸乙醇。 5．复染 加美蓝染液染lmin。 6．水洗后自然干燥、镜检 草分枝杆菌呈现红色。若用非抗酸性菌作为对照，则菌体被染成蓝色。 实验内容（了解芽孢染色的方法和步骤） 孔雀绿染色法：取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取巨大芽孢杆菌菌体少许混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7.6％的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用0.5％蕃红液染色lmin，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈现红色。 实验内容（了解荚膜染色的方法和步骤） 1．制片 加一滴6％葡萄糖水溶液于载片一端，挑取少量胶质芽孢杆菌与其混合，再加一滴黑色素充分混匀。用推片法制片，将菌液铺成薄层，自然干燥。 2．固定 滴加l～2滴无水乙醇覆盖涂片，固定lmin，自然干燥。 3．染色，冲洗 滴加结晶紫，染色2min，用水轻轻冲洗，干燥后镜检。 有荚膜的菌、菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。无荚膜的菌，由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能出现一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜，荚膜不着色的部分宽。 实验内容（了解鞭毛染色的方法和步骤） 1．载片的清洗：将载片洗净浸泡在95％乙醇中备用。 2．实验菌种的准备：将枯草芽孢杆菌在新制备的肉膏蛋白胨斜面培养基上(斜面下部要有少量冷凝水)，连续移种3～4次，每次培养12～18h，最后一次培养12～16h。 3．制片：擦干载片，在载片一端加一滴蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔底部有水部分的菌体(注意不要挑出培养基)，将接种环悬放在水滴中片刻，将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，可再返转一次使菌液流经面积扩大，然后放平，自然干燥。 4．染色（利夫森氏染色法） ：用蜡笔将涂菌区圈起，滴加染液，过数分钟后，当染液的1/2以上区域表面出现金属光泽膜时，用水轻轻将金属膜及染液冲洗干净，自