5第五章 目的基因导入受体细胞2PPT.ppt

第五章目的基因导入受体细胞;第三节 重组子的筛选;将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子 ），现在这两者有通用的趋向。 含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。 ;一、遗传表型直接筛选法;;选择培养基是： 根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。 选择物： 是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。;（一）根据载体选择标记初步筛选转化子;（1）抗药性筛选;;正向选择方式;（2）插入失活筛选法;双;双抗药性筛选;;（3）插入表达筛选法;例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的Hin dⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型。 质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。;（4）显色互补筛选法;;lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。;lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’区插入外源基因后，再转化lac Z’互补型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。 此方法主要用于原核生物。; α 互补的检测 ;;以显色剂x-gal作为选择物时: DNA对照组不应出现任何菌落； 感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色的； 感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应有白色的。 其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。 ;（5）利用报告基因筛选植物转化细胞;特征 　　作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件： 　　(1)已被克隆和全序列已测定； 　　(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； 　　(3)其表达产物能进行定量测定。 ;①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。;④β-葡萄糖酸酶基因（gus）;⑤萤火虫荧光素酶基因（luc）;⑥抗除草剂bar基因。bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。;（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 ;胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。 这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。 如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有上述基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。;二、核酸分子杂交检测法（p297）;待测的核酸序列;; 根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同。 ;又称DNA印迹杂交、Southern DNA印迹杂交;（1）提取总DNA （2）酶