C4 单抗与基因工程抗体2009PPT.pptVIP

非何杰金淋巴瘤的单抗治疗，使用单抗后，恶性B细胞被破坏 CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体 人源化抗体（该型抗体） (二) 人改型抗体（CDR移植） 鼠单克隆抗体V区的人源化 （三）人源抗体 完全人源化抗体又称全人抗体，是 治疗性抗体最理想的形式。目前，基因工 程制备全人抗体主要通过抗体库技术与转 基因小鼠技术而获取。 二、小分子抗体 概念：是分子量小但具有抗原结合能力的片段。 类型：抗原结合片段（Fab）、可变区片段（FV）、单链可变区片段(ScFv)、单区抗体(SdAb)和纳米抗体等。 特点：分子量小，穿透性强；不含Fc段，副作用少；半衰期短，有利于及时中和及清除毒素；可在原核系统表达及易于基因工程操作。 二、 小分子抗体 1抗原结合片断 2 可变区片断 3单链抗体 免疫球蛋白 基因载体的构建 H链表达载体 L链表达载体 共转染细胞 pr VH CH1 Pr VL CL Fab 抗体分子的制备 抗体分泌细胞 VH VL CL -S-S- CH1 Fab 抗体分子的制备 可变区片断 ds-Fv [二硫键稳定的Fv ]小分子抗体的制备 分别构建载体 L链表达载体 H链表达载体 共转染细胞 Pr VH Pr VL 抗体分泌细胞 VH VL -S-S- ds-Fv小分子抗体的制备 VH VL 接头DNA (Gly4Ser)3 VH引物 PCR VH 接头DNA 酶切、克隆 单链抗体（ScFv )的构建——基因工程技术 变性、复性 VL引物 VL 三、抗体融合蛋白 ?抗原结合部位与生物活性蛋白结合 四、双特异性抗体 六、噬菌体抗体库技术 抗体库技术——是指用基因克隆技术将全套抗体VH和VL 克隆出来，重组到噬菌体载体，通过工程菌（原核系统）直接表达有功能的抗体分子片段，最后通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因。 应用：抗感染，抗肿瘤，抗独特型抗体 抗体库技术产生的三项技术基础 ? RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 ? 抗体基因片段在工程菌的功能性表达 ? 噬菌体（丝状）展示技术 接头DNA VH VL 噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或基因VIII 外壳蛋白 VH VL 抗体库的构建 抗体库的富集筛选 多价抗原 多克隆 （致敏的B细胞） 多克隆抗体 多克隆抗体（PcAb）的制备 免疫学教研室 曾霞 第一代：多克隆抗体 第二代：细胞工程抗体（杂交瘤技术） 第三代：基因工程抗体 抗体技术的发展经历了三个阶段 多价抗原 多克隆 （致敏的B细胞） 多克隆抗体 多克隆抗体（PcAb）的制备 单克隆抗体(McAb)——是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。 杂交瘤细胞1 杂交瘤细胞2 杂交瘤细胞3 Mab1 Mab2 Mab3 Ag 第一节 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤技术原理： 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤?细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤?细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体 第一节 杂交瘤技术的基本原理 骨髓瘤细胞(同系小鼠)，具永生性 致敏的B淋巴细胞(免疫小鼠的脾细胞)，可分泌抗体 杂交瘤细胞（hybridoma） 既有脾细胞产生特异性抗体的功能，又有瘤细胞可长期在体外传代培养的特点。 一、 B淋巴细胞杂交瘤技术 （HAT抵抗的） 。（HAT敏感的） *B细胞：来源于免疫动物的脾细胞(spleen cells) 。 1、细胞的选择与融合 *骨髓瘤细胞： 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT或TK缺陷 与提供淋巴细胞的动物品系相同 *融合剂：聚乙二醇（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂。 2、杂交瘤细胞选择性培养 *未融合的脾细胞（B细胞）——不能在体外存活而死亡； *未融合的骨髓瘤细胞——合成DNA的主要途径被A（氨基碟呤）阻断，因缺乏HGPRT或TK，不能利用H或T完成DNA的合成过程而死亡； *杂交瘤细胞——由于从脾细胞获得HGPRT或TK ，故能在HAT中存活与繁殖。（HAT敏感的） HAT培养基： H（hypoxanthine）：次黄嘌呤 A(aminopterin)：氨基碟呤 T(thymidine)：胸腺嘧啶核苷 HAT选择培养原理 核苷酸从头合成途径（d