正式20120706-8渤海大学.ppt

对虾养殖源头镰孢菌及T-2毒素快速检测与抗菌肽抑制机理 王雅玲 教授 广东海洋大学 主要内容 研究的背景 对虾养殖源头镰孢菌的分布特征 基因组DNA的快速提取 tri5 拷贝量的强弱与毒素产物是否有关？ 免疫亲和柱净化条件 T-2毒素IMC-HPLC检测-衍生温度 T-2和HT-2毒素IMC-HPLC检测-检出限 T-2与HT-2毒素LC-MS/MS同步检测方法的建立 解决：tri5 拷贝量的强弱与T-2、HT-2毒素有什么关系？ 小 结 四、芽孢杆菌抗菌肽(BN-AP01)对镰孢菌的抑制效应和机制 抗菌肽对孢子萌发的影响 抗菌肽对产毒镰孢菌生长速率的影响 抗菌肽对产毒镰孢菌生物量的影响 抗菌肽对产毒镰孢菌菌丝形态的影响 抗菌肽对产毒镰孢菌孢子和菌丝超微结构的影响 抗菌肽对菌丝通透性的影响 展 望 BN-AP01可以作为对虾镰孢菌病和T-2毒素无公害控制的敲门砖！ 下一步： BN-AP01新型水产饲料添加剂的应用开发； BN-AP01对镰孢菌等病原真菌及其产毒的控制机制 * * 2012-7-8 辽宁锦州 Green Control of Aquatic food-borne pathogenic Microorganisms and Toxins 展 望 五 芽孢杆菌抗菌肽对镰孢菌的抑制机理 四 镰孢菌株的产毒特性 三 tri5-PCR技术快速筛选产毒镰孢菌株 二 一 对虾环境中镰孢菌的分离纯化与鉴定 一、对虾环境中镰孢菌的分离纯化与鉴定 1966- 日本冈山水产实验所，首次发现寄生日本对虾上的镰刀菌。 1985- 河北省，人工越冬期的中国对虾上首次发现镰刀菌病; 1987-浙江越冬期病虾上第一次分离到该病病菌； 此后-山东、江苏、辽宁等省，对虾越冬场分离到镰孢菌病原菌。 流行病学调查发现，其宿主种类和分布地区都很广。在海水中的各种对虾、龙虾和一些蟹类都可被感染，感染率高达70％，积累死亡率90％。（俞开康，2000） 镰孢菌是十足目甲壳类动物的一种危害很大的条件致病性真菌。 事件 论 结 1993-越冬期中国对虾中分离鉴定出四种镰孢菌，除腐皮镰孢菌外，尖孢镰孢菌、三线镰孢菌和禾谷镰孢菌等三种在国内外的养殖对虾上尚未见报道（战文斌等，1993） 对虾中的镰孢菌 究竟怎样发生的？ 海水 污泥 饲料 15.9±2.1CFU/mL 160.9±37.3CFU/mL 68.4±21.7CFU/mL 显著正相关 2. 养殖源头饲料中 镰孢菌浓度最高！ 1. 镰孢菌普遍存在于 对虾养殖环境中！ 镰孢菌病流行 镰孢菌毒素-食物链-蓄积和残留 无公害控制 产毒镰孢菌及其毒素快速检测 孔雀石绿、制霉菌素、福尔马林、高锰酸钾 药物残留 饲料中的真菌毒素通过动物和加工进入食品 潜在危害 结果表明 解决方案 解决思路：因为毒素由基因决定，采用分子生物学技术可行？ 二、tri5-PCR技术快速筛选产毒镰孢菌株 传统方法： 镰孢菌分离纯化 形态学鉴定 毒素检测 样本 判定产毒菌株 缺点：周期长；形态学要求认知程度高。 单端孢酶烯合成酶的起始基因 建立tri5-PCR技术可以作为产毒镰孢菌株的快速检测方法。 tri5基因是产单端孢酶烯的必要条件， tri5+菌株可视为产毒镰孢菌株 决定的单族毒素的基因簇（Edwards et al, 2001) tri5基因的表达，激活单族毒素 合成酶和调控酶的基因表达， 从而生成不同的单族毒素 Cenis DNA提取（Cenis，1992）优化法-微型电钻研磨法：快速、简便、提取量大，污染少 -20℃ 10min 加3M醋酸钠 水冲洗-酒精- 干燥 一定体积上清液 GYM 25℃/6d 富集菌丝 10000rpm/5min 微型灭菌圆锥型钻头 研磨 -20℃ 30min 等体积的冰异丙醇 去异丙醇/加70%的乙醇 （1） （2） （3 ） 10000rpm/ 5min Stock-DNA 保存-20℃ TE缓冲液 干燥 加SDS缓冲液 去GYM 二、tri5-PCR技术快速筛选产毒镰孢菌株 tri5-PCR扩增结果 TTTCTAGATGGAGAACTGGATGGTCTGGGTCAACGATCTTATGTCATTCTACAAGGAATTYGACGATGAGCGTGACCAGATCAGTCTCGTCAAGAACTACGTCGTCTCTGATGAGATCAGYCTCCACGAAGCTTTGGAGAAACTCACCCAGGACACTCTGCACTCGTCCAAGCAGATGGTWGCTGTCTTCTCGGACAAAGACCCTCAGGTGATGGACACGATTGAGTGCTTCATGCACGGCTACGTCACGTGGCACTTGTG（261bp）EF5