糖含量测定实验方案.docVIP

糖含量测定实验方案 1.还原糖浓度测定 简介 还原糖是指含有自由醛基和酮基、具有还原性的糖类。黄色的3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。 不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。 及试剂 分光光度计、电热恒温水浴锅、试管及试管架、容量瓶、移液器、量筒。 ①1mg/ml 葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。 DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸） 称取3，5—二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。 葡萄糖标准曲线制作 取9支干净试管编号，按表1加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 葡萄糖含量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 OD540 将以上溶液，封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25mL,以0号管为对照，在540nm下测定吸光值，以葡萄糖质量为纵坐标，吸光度为横坐标，拟合曲线。 样品中还原糖测定 样品中还原糖的提取 准确称取1.00g样品，放入100ml烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后补足至50ml蒸馏水，搅匀，煮沸5min,是还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min离心5min，沉淀可用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为稀释100倍的还原糖待测液（实际操作时可根据需要稀释至适当倍数：10、20、30、40、50、100、200等）。 表2 样品还原糖测定 试剂 0 1 2 3 样品溶液（ml） 0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水（ml） 2.0 1.0 1.0 1.0 DNS（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 OD540 通过标准曲线计算得到的还原糖量（mg） 样品中还原糖质量分数（%） 还原糖的测定 取4支试管，编号0、1、2、3.以制作标准曲线相同的方法，在1-3号试管分别加入1ml待测液和1ml蒸馏水，1.5ml DNS(保证与葡萄糖标准曲线制作相同的反应体系)，而对照的0号管内则加2ml的蒸馏水和1.5ml DNS.封口置沸水浴煮5min，冷浴冷却，定容至25ml.在540nm下测吸光度。 结果计算 计算光密度的平均值，根据所得标准曲线即可得到还原糖的质量C，按下列计算样品还原糖和总糖的含量。 计算公式由公式： 整理所得。 式中，还原糖（以葡萄糖计）的质量分数，%； C还原糖或总糖提取液浓度，mg/ml，本公式中C即为根据标准曲线计算得到的还原糖毫克数（测定时取用体积为1ml）； V提取液的总体积，ml（提取液的总体积即为稀释倍数）； M样品质量，mg。 实验注意事项 样品的稀释倍数要保证计算得到的葡萄糖浓度在标准曲线线性关系良好范围内。以往经验和文献报道表明，OD540在0.1-0.4范围内数据较为真实。 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620?nm处有最大吸收，在150?μg/ml范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30μg左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用