CN107022525-CN201710291427-用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107022525 A (43)申请公布日 2017.08.08 (21)申请号 201710291427.5 (22)申请日 2017.04.28 (71)申请人 中卫华医（北京）医院管理有限公司 地址 101111 北京市大兴区经济技术开发 区科创六街88号亦庄生物医药园E1- 501 (72)发明人 赵进军　何文丽　邱丽媛　谷广其　 李亚平　王晶　 (74)专利代理机构 四平国泰知识产权代理事务 所(普通合伙) 22213 代理人 韩富刚 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) 权利要求书3页 说明书10页 (54)发明名称 用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于肿瘤治疗的NK细胞培 养方法，为解决现有技术不能获得大量的、应用 安全的、纯度较高的NK细胞问题。其依次包括如 下步骤：1）分离单核细胞：2）单核细胞洗涤：3）NK 细胞培养；加入培养基，重悬；将用NK细胞因子包 被好的包被液吸出，再将细胞悬液转移到包被过 的培养瓶中，再加入自体灭活血清、培养；Day 1- 12 NK细胞前期扩增，每次扩增需加自体血清；NK 细胞后期扩增：在NK细胞后期扩大培养时使用 OKM200培养基，使用方法与OKM100一样，最后扩 9 增到1 ×10 以上即可；最后一次扩繁用培养袋培 养；Day12无菌检测后Day14 收获。具有可在体外 A 培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高 5 的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达 2 5 2 到能够安全有效的应用于临床的质量指标的优 2 0 7 点。 0 1 N C CN 107022525 A 权　利　要　求　书 1/3页 1.一种用于肿瘤治疗的NK细胞培养方法，其特征在于依次包括如下步骤： 1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要 的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有 FicoLL的离心管中，每管加入血液，旋紧盖子离心，注意血液要加到淋巴分离液的上层，切 勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到 样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、 粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞 层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀； 2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容混合 均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即 为单核细胞； 3）NK细胞培养；根据前步骤中测得的细胞总数，加入OKM100培养基，使细胞的接种浓度 6 为2-4×10/ml，重悬；将用NK细胞因子包被好的培养瓶中的包被液吸出，再将细胞悬液转 移到包被过的培养瓶中，再加入自体灭活血清；旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO 培养； 2 Day  1-12 NK细胞前期扩增：细胞生长到一定密度培养基颜色变黄时，需进行扩大培 养；NK细胞在前期培养时，必须使用营养成分高含有IL-2的OKM100培养基，