荧光分光光度法 仪器信息网.ppt

I f =2.303ФfI0-εbc 同时在c浓度小时,I f~C成线性关系.I f跟I0成正比∴I0增大可提高灵敏度。此定量分析，除多了个量子效率，跟紫外定量一致，又对于同一种物质时,在同一条件，仪器.T.溶剂均一致则Фf应一致。 2．实例： I f~C 经上公式推算，实质和紫外一致。在实际测量中。在找准λem波长带.找到λex(max).即可以UV类似方法定量.如 不同在于弛豫后波长-?红移 1.药物（西药类） A.采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶囊的含量，测定波长为Ex=287.0nm，Em=368.0nm。 B. SMZ λex=400nm , λem=510nm C.替硝唑 λex=360nm ,λem=420nm D.氟康矬 λex=261nm , λem=284nm 2.药物（中药） A.测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚，通过选取适当的光谱校正点可扣除厚朴酚与和厚朴酚的光谱干扰和背景干扰,方法用于生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的测定． B.香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱λem=(385±1)nm，λex=301nm或激发光谱λex：(328±1)nm，λem：425nm 3.无机元素 A.测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液中具有较强的荧光强度，λEx=446nm，λEm=506nm。 B.海藻产品中的硒，采用荧光分光光度法测定海藻产品中的硒含量。 C.探讨耐药逆转剂对耐药细胞K562／A02内游离钙离子([Ca^2+]i)浓度的影响 。 4.医学上 A.探讨谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟物．环糊精(2-Se-CD)对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠成纤维细胞(NIH3T3)制备紫外线损伤模型，采用荧光分光光度法测定DNA裂解率，改良硫代巴比妥酸荧光法测定细胞脂质过氧化作用，流式细胞术测定H2O2。 B.采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中α－二羧基类化合物生成荧光诱导体，然后用以相ＨＰＬＣ－荧光对大白鼠组织及食物中的乙二醛，甲基乙二醛 ，二乙酰和２，３－二酰丙酮４种α－二羧基类化合物同时进行分离定量检出，荧光检出波长为λEx=350nm，λEm=390nm ， 5.药代动力学 A.建立测定大鼠血浆中环丙沙星的RP-HPLC荧光检测法和研究其体内的药物动力学。荧光检测，λEX=276nm, λEM=448nm。 B.测定血液中左氧氟沙星的HPLC荧光检测法和研究其体内的药物动力学。荧光检测，λEX=315nm, λEM=440nm。 测血清中心律平含量.以往有用HPLC法测,此法,a.前处理麻烦.b.成批测量较好. 而改用荧光衍生化薄层色谱测时. 用丹磺酰肼对心律平中的羰基衍生化.则可克服以上缺点.在后面讲到最新的荧光测定可进行薄层色谱测定. 六:荧光光度计的发展 发展:1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化 随科技发展,激光,微机,电子学等新技术引进,推动了理论上的发展. 1. 分辨率提高： ①48000S可测荧光寿命范围15μs～5ps,分辨率达±2.5ps. ② 48000SGH2型可测荧光寿命范围5.2μs～1ps,分辨率达±0.5ps. 2.扫描速度加快 日立的F-4500型其中三维荧光测定为固有装置,扫描速度达30000nm/min∴三维荧光测量只需2～3 min. 3.多功能： PE公司的LS-50B发光分析仪,可同机进行荧光、磷光和化学发光测量，利用光纤传感的平板扫描仪附件还可进行薄层色谱分离斑点的扫描测定；采用8.3W的脉冲氙灯，同机可测磷光；相应的软件能获得三维方式或文件轮廓显示的谱图. 4.促使应用技术的扩展 ①时间分辨(相分辨) ②荧光偏振(荧光免疫) ③同步荧光 ④三维荧光和 ⑤(美SLM亚明科公司.)荧光光纤化学传感器等分析新方法相继出现10-6S级荧光寿命的测定。 荧光测量新技术及应用: 荧光偏振及各向异性: 1.在偏振光的激发下.荧光体所发射的荧光在空间不同取向的强度不同,亦是偏振光. 2.荧光偏振值P和各向异性r的公式 P=I1-I2/ I1+I2 r= I1-I2/ I1+2I2 式中I1和I2分别为检偏器的取向平行或垂直于起偏器取向时所观察到的荧光强度. 3.荧光偏振不仅与荧光体分子形状大小,荧光体吸光对偏振激光的取向、光选择性以及许多外界因素都有关，用处很大.比如环境的粘度等都会影响和改变其偏振度.从而在生化领域中获得广泛的应用. ①大小:可用于确定生物分子间的缔合反应量(缔合量大,则转速小,偏振度加大) ②粘度:膜内微粘度对偏振影响 ③对蛋白质的衰变和转动速度的研究,在荧光体的偏振度与荧光体的转动