第四章 哺乳动物基因工程精选.pptVIP

一、高等哺乳动物基因工程的基本概念 转基因动物：是借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体。 制备转基因动物的步骤：获得和改建目的基因，将目的基因向生殖细胞高效转移，受精卵或胚胎组织在合适的环境中的发育，筛选、鉴定稳定的细胞系。 二、目的基因的选择 　 四类目的基因：　 一是编码蛋白质的基因； 二是调节机体免疫反应和抗病性的基因； 三是单一的主基因； 四是治疗人类遗传病所需要的蛋白质的基因 三、转移基因的导入方法 1.原核期胚胎的显微注射法：　基本原理：通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵（雄原核内），利用受精卵繁殖中DNA的复制过程，将外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。 具体：在显微镜下，用直径约为1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核内，将毛细管内所带有的外源基因的DNA注入原核，然后将其移植到假孕母体输卵管或子宫内并发育成子代个体。　　 优点：外源基因转移率高，外源基因的长度不受限制（导入的外源基因片段可长达50 kb），且无需载体，，试验周期相对较短。 缺点：转移基因往往串联整合，表达不稳定，不能将外源基因导入发育较晚的胚胎细胞，并且效率低，价格高 2.逆转录病毒载体法： 基本原理：将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎与能释放逆转当病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。 优点：对插入位点克隆分析较为容易，基因整合率高，单拷贝整合等。 缺点：逆转录病毒作为载体有致癌性，胚胎对病毒侵杂有抗生，插入的基因大小受限制等。 　3.精子载体法：　　这是一种直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法。精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可直接进入精子头部，受精后能发育成转基因动物。Rottman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，脂质体与DNA相互作用形成脂质体—DNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞膜融合，从而进入细胞内。尽管该方法的可靠性尚难定论，但它简便经济，许多研究者在不断控索和改进这种方法。 　4.胚胎干细胞（ES）介导法：　 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）：是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。 基本原理：将外源基因直接导入ES细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。 优点：基因整合率，可在特殊的可选择位置诱导突变。 缺点：ES细胞建株很困难，需要预先选择和克隆基因转移型细胞，目前小鼠ES细胞系虽已建立，但在猪、羊中还未能得到真正稳定的ES细胞株。 5.人工酵母染色体法：　　酵母人工染色体（YAC）载体是近年来发展起来的新型载体，具有克隆百万碱基对级的大片段外源DNA的能力。 优点：保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变，保证较长的外源片段在转基因动物研究中整合率的提高，鉴于基因的完整性，目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效应。 6.细胞核移植法 ： 基本原理：首先用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选择阳性细胞作核供体，通过细胞核移植，获得基因动物。 优点：可与基因打靶技术结合，实现外源基因的定点整合，消除外源DNA随机整合带来的负作用。转基因效率高，可达100%，大大降低转基因家畜的生产成本。 缺点：广泛应用还依赖于体细胞克隆技术的发展，目前还难以实现。 其它转化法： 电脉冲法 染色体片段注入法 磷酸钙共沉淀法 微弹轰击法 原生殖细胞介导 四、转移基因的整合和表达 1.转移基因的整合：　　线性DNA比环状DNA更容易整合；线性DNA导入后易环化；所有DNA分子整合在同一染色的同一位置；整合的分子以串联方式排列；不同DNA一起导入时是在一起整合。 2.转移基因的表达：　　外源基因在转基因动物体内有三种方法进行表达 （1）在一种细胞内特异表达，绝大多数属于此类； （2）外源基因在所有器官显著表达，改变动物表型和原来性状； （3）外源基因在动物发育的适当时期与内源基因一起激活。 目前研究的表达系统有两种： 一是乳腺表达系统：乳腺作为特异表达重组蛋白的器官，易收集产品而不损害动物。 另一种是MAR（基质结合区）的转基因的表达： 五、转基因动物的应用 1、转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研