第三章 沉淀与泡沫分离.ppt

* 图3.14 蛋白质的连续泡沫分离过程流程图 * 3 初级分离 内容提要 3.1沉淀分级 3.2泡沫分离 * 初级分离特点 初级分离：从各种原料（菌体发酵液，细胞培养液，细胞破碎液，及其他各种生物原料）中初步分离和浓缩得到一定浓度的目标产品。 初级分离的对象：体积大，杂质含量高； 初级分离技术：操作成本低，适于大规模生产。 * 3.1 沉淀分级 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。 结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为结晶法。 沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。 * 特点 优点：成本低，收率高(不会使蛋白质等大分子失活)，浓缩倍数高，操作简单。 缺点：分辨率低，产品杂质多，适合于生化物质粗提纯阶段，需和其它方法交替使用。 * 3.1.1 蛋白质的表面特性 正电荷 负电荷 亲水区 疏水区 * + + + + + + + + + 等电点时的蛋白质（亲水胶体） 带负电荷蛋白质（亲水胶体） 脱水 脱水 脱水 带负电荷蛋白质（疏水胶体） 不稳定蛋白颗粒 阴离子 阳离子 碱 酸 酸 碱 + + + + + + + + + 水化膜 蛋白质聚集沉淀 * 3.1.2 盐析沉淀 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现： “盐溶”—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 “盐析”—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： 无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； 中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。 * 盐溶和盐析 溶解度 盐浓度 Salting-out Salting-in lgS I * 蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强。 盐溶 疏水区 * β，Ks—常数 S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c: 离子浓度； Z：离子化合价 Cohn 经验公式 lgS=β-KsI * β与Ks的物理意义 β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 * Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析； 其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 * 3.1.2.2 影响盐析的因素 无机盐（最有效的盐是多电荷阴离子） 阴离子（电荷多，离子半径小效果好）： PO43- SO42- CHCOO- Cl- NO3- ClO4- I- SCN- 阳离子： NH4+ K + Na + Mg2+ * (2) 温度和pH 在高离子强度溶液中，温度升高，溶解度降低。一般在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0～4℃下操作。 等电点处溶解度小，调整体系pH值，使在pI附近。 （3）蛋白质的浓度 蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；较适中的蛋白质浓度是2.0～3.0％。 * 中性盐的选择 常用的中性盐是(NH4)2SO4，突出的 优点： (1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 * 几种盐在不同温度下的溶解度（g/100ml水) 温度 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫酸铵在0℃时的溶解度，远高于其它盐。 * (2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 (3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久