用黑麴菌的液态醱酵生产葡萄糖酸ProductionofGluconicAcidby.PPT

用黑麴菌的液態發酵生產葡萄糖酸Production of Gluconic Acid by Submerged Culture of Aspergillus niger 動物碩一 R9833201 廖柔彎 99.06.17 前言 葡萄糖酸以及衍生的金屬鹽類可應用於食品添加物、化妝品、營養加強劑、水質穩定劑、鋼鐵表面清潔劑以及水泥的掺合劑。 葡萄糖酸是葡萄糖氧化或生物發酵可生產葡萄糖酸(Gluconic acid)又稱 D-葡萄糖酸(D-Gluconic Acid)，分子式 C6H12O7 。 葡萄糖酸直鏈式結構 葡萄糖直鏈式結構 菌種 葡萄糖酸的生產，主要是利用黑麴菌（ Aspergillus niger ）發酵，具有專一的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶等。 麴菌的生長是藉由孢子到處散佈，菌落開始生長時呈白色，等到分生孢子成熟後，才會顯現各種其特別的顏色。 培養方法 平板培養基： 菌種培養於Potato Dextrose Agar（ PDA ）， 於30℃培養 3~5 天，形成黑色孢子，可保存 1~2個月。 液態搖瓶培養： 150 mL 的液體培養基於加入 50 mL 的孢子懸浮液（3 × 106 孢子/mL）。在 30℃、200 rpm、振盪培養 12 小時，當作接種發酵槽的種菌。 培養基成分是：葡萄糖 50 g/L、 (NH4)2HPO4 1 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、 MgSO4?7H2O 0.15 g/L (pH 7) 發酵槽培養基： 3 公升培養基於 5 公升發酵槽中操作。 孢子的計算 製備孢子懸浮液，將 PDA 平板培養基做在 500 mL 三角瓶的底部，加入滅菌的 0.02% Tween-20 溶液，振盪數分鐘後，即形成孢子懸浮液（圖 1和圖 2）。 將孢子懸浮液放在細胞計數玻片，蓋上蓋玻片，用顯微鏡放大 400 倍觀察。 計算16 小格的孢子總數，再算出每小格的平均數（圖 3）。 每小格面積 0.0025 mm2，深度 0.1 mm，所以每小格的體積是 2.5 ×10–7 cm3，亦即每小格平均有一個孢子時，孢子的濃度就是 4 ×106 個 / mL。 圖 1 圖 2 圖 3 發酵槽操作程序 培養基（葡萄糖 120 或 150 g/L、(NH4)2HPO4 1 g/L、 KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4?7H2O 0.15 g/L） 121℃滅菌 15 分鐘 接種 300 mL 的黑麴菌液態搖瓶培養液 設定發酵槽的攪拌速度為 600 rpm、溫度 30℃、通氣 1 vvm、pH5.5 以下時自動饋入 20%的 Ca(OH)2 來調整。 取樣，加水稀釋 50~100 倍（因為形成葡萄糖酸鈣，溶解度很低），離心，用濾孔 0.2 μm 的針筒過濾器過濾，用 HPLC 分析。 結果 葡萄糖酸和葡萄糖的 HPLC 分析 採用的 HPLC 分析是使用逆相層析管（Merck RP-18e），移動相 Acetonitrile：water（30：70），流速：0.5 mL / min。 圖 4 葡萄糖、葡萄糖酸的 HPLC 層析圖 3.27 min 2.70 min 結果 菌絲形態 圖 5 黑麴菌搖瓶培養12小時的菌絲形態 圖 6 五公升醱酵槽中黑麴菌培養 21 小時的菌絲形態 120 g/L 的葡萄糖醱酵生產葡萄糖酸 13h 結果 24h pH 5.5 圖 7 醱酵過程葡萄糖及葡萄糖酸濃度的變化（葡萄糖 120 g/L） 結果 150 g/L 的葡萄糖醱酵生產葡萄糖酸 圖 8 醱酵過程葡萄糖及葡萄糖酸濃度的變化（葡萄糖 150 g/L） 6h 13h pH 5.5 32h 兩種葡萄糖濃度的發酵結果沒有顯著差異。 表 1 的結果顯示有 6～7％的葡萄糖在醱酵過程轉變成細胞成分或消耗成能量。 低濃度葡萄糖的生產速度（5.2 g / L?h）大於高濃度葡萄糖的生產速度（4.8 g / L?h）。 其原因可能有二： （一）低濃度葡萄糖的滲透壓較低，有利於黴菌的生長 和代謝。 （二）低濃度葡萄糖的有利於氧氣的傳輸，葡萄糖轉變 成葡萄糖酸需要大量的氧氣，而高濃度葡萄糖是 比較不利於氧氣的傳輸。 表 1 五公升醱酵槽培養黑麴菌生產葡萄糖酸的結果 討