试验3过氧化物酶活性测定.PPT

实验3 过氧化物酶活性测定 过氧化物酶介绍 过氧化物酶(peroxidase)是以血红素为辅基，它催化H2O2直接氧化酚类或胺类化合物，反应如下： R + H2O2 RO + H2O 或RH2 + H2O2 R + 2H2O 清除细胞内的过氧化氢和保护酶蛋白以及植物细胞中木质素的形成活动中有重要意义。 酶活性单位 酶活性单位— 规定的pH、T、[S]条件下，测定单位时间内底物的消耗量或产物的生成量。 酶国际单位— 1分钟内使1umol底物转变的酶量 一、目的 掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。 二、原理： 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为： 三、实验材料、主要仪器和试剂 (见教材） 1、酶提取缓冲液：20mmol/L硼酸缓冲液（pH8.8），内含5mmol/L亚硫酸氢钠（临用前加） 2、0.1mol/L醋酸缓冲液（pH5.4） 3、0.25%愈创木酚（溶于50%乙醇中）溶液（临用前配） 4、0.75%过氧化氢溶液（临用前配） 四、操作步骤 1．酶液提取：取植物样品0.3g（表面水分吸干），剪碎置于研钵中，加入4ml预冷的酶提取液，研磨成匀浆（冰浴），转入离心管，再用2mL提取液冲洗研钵，一并转入10ml离心管，平衡后于8000转/分钟离心20分钟（低温）。将上清液倒入25ml比色管中，定容至10ml，插入冰浴待测。 2．分光光度计预热20分钟后，比色（见教材）。 结果计算 以每分钟光密度变化（以每分钟OD470nm变化0.01为1个活力单位）表示酶活性大小，即 过氧化物酶活力= U/min·mg（FW） 注意事项 1、酶液浓度要适当。 2、酶液中不能有颗粒物质。 3、精确控制比色皿中所加酶液的量。 4、精确控制时间，读数要及时。 思考题 植物不同部位叶片或不同器官过氧化物酶活力有何差异？为什么？ * * ROS主要来源 线粒体：超氧阴离子O·-2，是体内O·-2的主要来源； O·-2在线粒体中再生成H2O2和·OH。 过氧化酶体：FAD将从脂肪酸等底物获得的电子交给O2生成H2O2和羟自由基·OH。 胞浆需氧脱氢酶（如黄嘌呤氧化酶等）也可催化生成O·-2。 细菌感染、组织缺氧等病理过程，环境、药物等外源因素也可导致细胞产生活性氧类。 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。