第五章酶的提取与分离纯化概要.ppt

第五章 酶的提取与分离纯化 酶的分离纯化 ——将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需酶制品的过程。 酶的制备流程： 材料选择——细胞破碎的各种方法及原理——酶抽提的各种方法、原理及注意事项——离心分离原理及方法——过滤与膜分离——沉淀分离的方法——层析分离各种方法——电泳分离原理及方法——酶的结晶——浓缩与干燥 把生物技术在研究、开发及应用于生产工艺过程的工作分为上游及下游两个部分。 下游（后处理工艺）（down stream process）： 如何高收率、高纯度、高质量的从微生物的发酵液中、细胞培养液中及动、植物组织的提取液中得到所需的产品。 第一节 细胞破碎 细胞破碎的目的是破坏细胞外围使胞内物质释放出来。 微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支撑细胞的作用。 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏的功能。是细胞破碎的主要阻力。 细胞膜(内壁):是一层半透膜。膜较薄，主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。 抽提胞内酶：需将细胞壁破碎 破碎细胞方法： 动植物细胞：高速组织捣碎机 组织匀浆器 微生物细胞：机械破碎法 酶法 化学试剂法 物理破碎法等多种。 细胞破碎方法及其原理 一、机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法 1、机械捣碎法 常用于较脆嫩的组织细胞破碎：动物内脏、植物叶芽等，也可用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。 2、研磨法 常用于微生物和植物组织细胞的破碎：设备简单，效率较低。 3、匀浆法 用于破碎那些易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞，细胞破碎程度较高，其机械切力对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。 二、物理破碎法 各种物理因素： 温度、压力、声波等的作用，使组织细胞破碎 多用于微生物细胞的破碎。 1、温度差破碎法 利用温度的突然变化，热胀冷缩的作用使细胞破碎。 对那些较脆弱、易破的细胞破碎效果好，但在酶的提取时，不能在过高或过低温度下操作，以免酶失活。 此法难以用于工业生产。 2、压力差破碎法 （1）高压冲击法 （2）突然降压法 取决因素：a.压力差 b.压力降低的速度 c.细胞种类和生长期 此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最好使用对数生长期的细胞。 （3）渗透压差法 方法：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或20％蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破碎。于是，细胞内容物就释放出来。 适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞，或者细胞壁预先用酶处理，或者在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。 对革兰氏阳性菌不适用,为什么？ 由于革兰氏阳性菌的细胞壁由肽多糖组成，可以承受渗透压的变化，而不致细胞破碎。 3、超声波破碎法 超声波：耳朵可听到的声音频率范围为16-20kHz，频率高于20 kHz的波。 机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。在超声波作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。 由于空化作用而使液体形成局部减压引起液体内部发生流动，旋涡生成与消失时，产生很大的压力使细胞膜破裂到达破碎细胞的效果。 细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 应根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频20 kHz；功率100～150W；温度0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。 超声波破碎法特点： 处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失少、效果好； 是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物细胞的破碎。 超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却剂进行冷却。 4、反复冻融法 方法：将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需反复多次。 冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 5、干燥法 细胞干燥法