引物primers设计知识介绍引物primers引物是人工-中国试剂网.pdfVIP

中国试剂网 3.12.3.5 引物（primers)设计知识介绍 引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条 DNA 模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条 DNA 模板链互补。 引物的重要性 在整个 PCR 体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR 的特异性要求引物与靶 DNA 特异结合，不与其他非目的 DNA 结合，PCR 的灵敏性要求DNA 聚合酶能 对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR 结果密切相关。 引物设计原则 1.引物长度 引物长度 一般为 15-30 个核苷酸，在做长片段 PCR 或做某些特殊的 PCR 时应使用较长的 引物，但最多不超过 50 个核苷酸。 2.碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5 个 GC 含量一般 40-60% GC 含量太低导致引物 Tm 值较低，使用较低的退火温度不利于提高 PCR 的特异 性 GC 含量太高也易于引发非特异扩增。 3.引物 Tm 值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于 20 个碱基的引物，Tm 值可根据 Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算 对于较长引物，Tm 值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位” 的计算方式得到， 这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) - 273.15 4.引物二级结构 引物二聚体 中国试剂网 3.12.3.5 尽可能避免两个引物分子之间 3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物 3’端形成发夹结构，否则将严重影响 DNA 聚合酶的延伸。 5.引物 3’端 引物的延伸从 3’端开始，因此 3’端的几个碱基与模板 DNA 均需严格配对，不能 进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致 PCR 扩增完全失败。考虑 到密码子的简并性，引物 3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。 6.引物 5’端 引物 5’端可以有与模板 DNA 不配对碱基，在 5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列 （酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 7. 引物的内部稳定性 过去认为，引物 3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故 3’端最好为 G 或 C 。 现在的观点认为，引物的 5’端应是相对稳定结构，而 3’端在碱基配对的情况下 最好为低稳定性结构，即 3’端尽可能选用 A 或 T，少用 G 或 C 。 仅仅 3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发 引物延伸的。 如果 3’端为富含 G、C 的结构，只需 3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发 延伸，造成假引发。 8.引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 9.扩增区域的二级结构 模板 DNA 的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域 尽可能避开这些区域。 扩增区域的自由能（△G 。）小于58.61kJ/mol 引物 Tm 值与 PCR 产物 Tm 值相差一般不超过 30℃ Tm product = 81.5 16.6 log ([K ]/(1 0.7[K ])) 0.41 (%G %C) - 500/length 中国试剂网 3.12.3.5 引物与 PCR 引物浓度：一般为 0.1-0.5umol/L 引物浓度(uM)=n OD×33/ （A×312 ＋C×288 ＋G×328 ＋T×303-61 ）/VH2O VH2O (单 位：L) 退火温度 最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) 0.7 × (Tm of product) –