紫外吸收法蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键.pptVIP

? 两种测定蛋白质含量方法的实验比较 目的要求 （1）学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。 （2）学习紫外吸收法测定蛋白质的原理和方法。 （3）比较两种测定蛋白质方法的优缺点。 实验原理 一、双缩脲法： 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物其最大光吸收在540nm处。 蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg /mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 二、紫外吸收法： 蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。 紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。 此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可测定蛋白范围应在0.1~1.0mg /mL。 ? 试剂和器材 试剂： 双缩脲试剂： 材料 1.??标准蛋白溶液 两种浓度的结晶牛血清白蛋白溶液(BSA)。 ??? ?2. 待测蛋白质溶液 人血清（稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。） 操作方法 一、制作标准曲线 二、样品测定 三、计算 取两组测定的平均值计算： 血清样品蛋白质含量（mg/100mL）= 其中,Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mL），N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。 Y x N V ? （1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 （2）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。 （3）由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。 注意事项 思考题 1．干扰双缩脲实验的因素有哪些？ 2．若样品中含有核酸类杂质，应该如何校正实验结果？ 3. 试比较两种常用蛋白质定量测定方法的优缺点。