现代分子生物学技术 2.pptVIP

分子生物学研究方法 DNA和RNA被称为多聚阴离子（polyanions），核酸分子放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 （二） 核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 DNA/DNA 或DNA/RNA 材料：尼龙滤膜 、硝酸纤维素滤膜 、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 4、原位杂交（in situ hybridization ） 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。 同时该酶具有从5‘→3’的核酸外切酶活性,能从切口的5‘端除去核苷酸。 由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。 随机引物法 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。产物平均长度为400-600个核苷酸。 （2）单链DNA 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 从RNA合成单链cDNA探针 步骤： 1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。 （四）基因扩增 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 第一次PCR 循环的结果是产生两个靶序列的复制。 2、PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ （2）DNA 聚合酶 (3)镁离子浓度: Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异扩增，一般常用1.5mmol/L （五） 核苷酸序列分析 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。 如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”。 作业： 1、凝胶电泳的原理是什么？有哪两种，分辨范围各是多少？凝胶的浓度和分辨率的关系是什么？ 2、什么是核酸分子杂交？几种杂交方法的过程各是什么？ 3、探针的类型有哪些？叙述一种探针的制作过程。 4、什么是细菌转化？其步骤如何？ 5、什么是基因体外扩增？步骤如何？ 6、Sanger双脱氧链终止法的原理和过程各是什么？ （七）实时荧光定量PCR 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 实时荧光定量PCR的几种方法介绍： 1、SYBR Green I法：SYBR Green I是一种只与DNA双链?的小沟部位结合的荧光染料。 基本过程是： 开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。 DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。 在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。 聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。 因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。 2、TaqMan探针技术 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的5′ →3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) 。 当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′ →3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告