第二十一章-常用分子生物学技术的原理及应用.pptVIP

第二十一章 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR） 一、基本工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3’和5’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。 重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。 （一）PCR体系基本组成成分 第一轮循环 第二轮循环 第三次循环 四、PCR的主要用途 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis 一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5′末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 二、DNA链末端合成终止法 又称Sanger法，其基本原理如下： 2’，3’-双脱氧核苷酸（ddNTP） 无3’碳原子上的羟基，故不能与下位核苷酸形成磷酸二酯键。 DNA合成反应在此终止。 DNA链末端合成终止法基本原理 DNA链末端合成终止法基本流程 生物芯片技术 * * 分子杂交特性（见第二章） 探针技术 印迹技术 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 利用DNA变性与复性这一基本性质来进行DNA或RNA定性或定量分析的一种技术。 一、分子杂交与印迹技术的原理 一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术 (末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影《侏罗纪公园》，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？答案是没有) PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大百万倍 染色体 Mullis (1993) 含Mg2+的缓冲液 dNTPs 耐热DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶 特异性引物 一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。 模板DNA （二）PCR基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 循环 25~30 次 使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除 使引物和模板DNA退火结合 此温度下DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长 三个步骤为一个循环， 每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 变性（95℃） 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 退火（60℃） 延伸（72℃） DNA-Pol DNA-Pol 温度 5/ 5/ 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 5/ 引物A 引物B 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 5/ 5/ 5/ 5/ 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 5/ 60 75 85 95 90 80 70 65 55 50 45 40 35 30 ℃ 5/ 变性（95℃） 退火（60℃） 延伸（72℃） 温度 DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol DNA-Pol 基因组DNA DNA样品 第一次循环 第二次循环 第三次循环 第四次循环 待扩增序列 引物A 引物B 3/ 5/ 3/ 5/ 5/ 3/ 5/ 3/ PCR的 用途 基因突变 分析 基因的 体外突变 目的基因 的克隆 DNA 序列测定 DNA和RNA 的微量分析 1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因； 2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段； 3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段； 4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突