蛋白诱导表达-2017年分子生物学实验.pptVIP

实 验 九 蛋白质的诱导表达 9.1.1 实 验 目 的 掌握蛋白质诱导表达的原理 学习蛋白质诱导表达的方法 了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点 外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品 需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞 基因工程的最终目的 主要步骤 制备表达载体 制备目的DNA 将目的DNA 克隆到载体上 操作 1. 酶切, 去磷酸化 2. 胶回收纯化 1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切 3. 胶回收纯化 1. 目的片断与载体连接 2. 转化非表达型宿主菌 3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒提取酶,测序确定阅读框 蛋白表达操作流程 转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白 1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株 1. 检测质粒稳定性 2. 确定表达时间和温度的最佳条件 3. 分析蛋白溶解性和活性 4. SDS, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 4. 切除融合标签并去除蛋白酶 蛋白质表达系统 原核表达系统 真核表达系统 大肠杆菌 枯草芽胞杆菌 YEAST CELL CULTURE INSECT CELL TRANSFERRED GENE 简单,便宜,大量,无修饰 复杂,昂贵, 有修饰 大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。 9.1.2 原核表达的特点 细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 缺乏翻译后加工体系 不溶性的包涵体 在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大 目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导 充分诱导: 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后达细胞总蛋白的50%以上 非诱导条件下: 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录 结构基因：编码?-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。 操纵子：包括启动子、操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白 乳糖+阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。 9.1.3 乳糖操纵子 9.1.4 诱导原核表达的原理 E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，其基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 9.1.5 蛋白原核表达载体 具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列，可供筛选的遗传性状，MCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、SD序列、及转录终止子等元件。 pET系列：6 His Tag （660Da-2kDa） pGEX系列：GST （26kDa） pMAL系列：Maltose Binding Protein （52kDa） pET系列 pGEX系列 pMAL系列 9.1.6 融合蛋白 融合蛋白: 将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接, 融合阅读框表达出一杂合蛋白 融合标签: 1. 保护目的蛋白使之不被降解 2. 用于检测和纯化目的蛋白 3. 增加目的蛋白在细胞质中的可溶性 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中 以提高其生物活性 9.1.7 阅读框架的保证 pGEX系列 DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。 影响转录水平的因素：强启动子，强终止子 等。 影响翻译水平的因素：SD序列，mRNA稳定性等。 影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。 9.1.8 影响表达效率的主要因素 9.1.9 优化表达 （1） 增加蛋白质溶解性及折叠: 温度: 37 ?C 蛋白质以聚集的形式表达--包涵体 30 ?C 可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位: 有利于蛋白折叠及二硫键的形成 稀有密码子: 多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E.Coli很少 使用, 当异源目的基因的m