第二章节蛋白质的检测和分离课件幻灯片.pptVIP

第二章节蛋白质的检测和分离课件幻灯片.ppt

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六、毛细管电泳 毛细管电泳(Capillary electrophore s is,简称CE)也常称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,简称HPCE),是以内径20-200 μm的柔性毛细管柱作为分离通道,以高压直流电场为驱动力,对各种小分子,大分子以致细胞等进行高效分离,检测或微量制备等的有关技术的总称。 毛细管电泳仪基本结构图 毛细管: 长:47cm, 57cm, 67cm; 直径:5-200 μm 进样系统:气压进样、电压进样。 冷却系统: 液冷、风冷。 高压系统: 1-30kV。 毛细管电泳的检测器:紫外检测器、二极管阵列检测器、激光诱发荧光检测器、电化学检测器、质量(质谱)检测器等。 PRINCE 700毛细管电泳仪 CEC-加压毛细管电色谱 毛细管电泳的分类 1、毛细管区带电泳(CZE) 2、分子体积排除(筛滤)电泳或 凝胶电泳(CGE) 3、等电聚焦电泳(IEF) 4、胶束电动力学电泳(MECC) 5、等速聚焦电泳(ITP) 毛细管电泳的主要优点 1、高灵敏度 2、高分辨 3、速度快 4、进样少 5、成本低 高灵敏度:紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间,荧光检测可达10-19—10-21mol 高分辨:峰分离效率超过1百万理论塔板数,一般可达几十万。 速度快:许多分析在10分钟内完成。 进样少:一般需要毫微升的进样量。 成本低:一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。 毛细管电泳的应用领域 小型离子 小分子 肽类 蛋白质 低聚核苷酸 DNA 第六节 蛋白质的结晶 结晶法是提纯蛋白质的一种手段。 当蛋白质提纯到一定纯度(大约是50%)时,就可以进行蛋白质结晶。 常用的方法有:盐析法;有机溶剂法;复合结晶法;平衡透析法;气相扩散法;pH诱导法;温度诱导法等。 现在,蛋白质结晶,主要应用在制备适合X-射线衍射研究、中子衍射研究的单晶样品。 适用于这种研究的最小晶体,其线性大小至少要在0.2mm以上。要让晶体长成这样的大小,必须寻找适宜的结晶条件。 结晶条件 1、纯度(purity) 样品纯度越高,结晶越容易。 混杂蛋白的存在,有时是影响单晶长大的主要障碍,甚至于影响微晶形成。 但多大纯度才能出结晶,没有统一的标准,通常不应低于50%。 结晶条件 2、蛋白浓度 结晶母液通常应保持尽可能高的蛋白质浓度。浓度越高,结晶机会越大。 这是因为蛋白质分子的扩散速度慢,浓度越高,分子间相互碰撞聚合的机会增多。在稀溶液中不易形成晶核。 对大多数蛋白质来说,浓度在5-50mg/mL为好。 在过饱和状态下结晶,杂质含量多,而且晶形也不好。 结晶条件 3、温度 温度可在0℃-40℃之间选择。 一般在低温下进行。 低温,不仅使蛋白质的溶解度降低,而且也不易使蛋白质变性。 结晶条件 4、结晶时间 视各种蛋白质的具体情况而定。 从浓盐溶液中结晶,形成结晶中心的时间短(几个小时),但晶体生长较慢(需数周、数月)。也有例外,如;牛肝过氧化氢酶从盐溶液中形成大的单晶只需12—24小时。 晶体大小与结晶时间、结晶条件有关。大晶体通常是生长较慢的情况下得到的。 结晶条件 5、pH值 调节溶液的pH,通常可以使晶体长到最适大小,也可以改变晶形,但要注意蛋白质的稳定性。 结晶溶液的pH,一般应选在被结晶蛋白质的等电点附近,这样,有利于晶体的析出。 2. 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细(5~10?m),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。 (四)液相色谱的流动相 1. 流动相特性 (1)液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。流动相组成改变,极性改变,可显著改变组分分离状况; (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相的极性小于固定相的极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性,则称为反相液液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2. 流动相类别 按流动相组成分:单组分和多组分; 按极性分:极性、弱极性、非极性; 按使用方式分:固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 乙腈、水、缓冲液。

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