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体外培养 天津市灏洋科技有限公司讲座 体外培养 实际上就是从活体内取出组织、单个细胞 和细胞群以及器官模拟体内生理环境，在无菌、适当温度、湿度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法 体外培养目的与用途 体外培养在现代医学和生物科学研究中应用极为广泛，其优点主要是： 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作。 便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，能直接观察细胞变化，可用于药物作用机理、基因功能、疾病发生机理、新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程药物、 研究与开发、单克隆抗体制备 体外培的养细胞所携带的基因与体内细胞相同，可用于分子生物学和基因工程的研究 细胞培养 原代细胞培养 细胞培养 传代细胞培养 细胞培养 原代培养（Primary Culture）： 原代培养是指从活体体内取出细胞或组织的第一次培养也称初代培养。一般持续1~4 周。此期细胞移动活跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上非常相似。 原代培养 原代培养方法可分为组织块法和消化法： 组织块法：取组织后，用Hank’s液清洗，去弃多余组织，直接剪成1mm3小块，铺于培养瓶或培养皿中培养。 消化法：取组织后，用Hank’s液清洗，去弃多余组织，用剪刀剪碎，加入消化液，37℃；水浴消化20-40分钟后，加入血清或培养基终止消化，离心去消化液，清洗，加入培养基并调整细胞数，接种于培养瓶或培养皿中培养。 细胞培养 传代细胞培养： 指原代培养成功后细胞再培养称之为细胞系。 传代细胞培养又分为有限细胞系和无限细胞系。 细胞培养 有限细胞系：指细胞群体在体外生长有一定的限度，即体外传代到一定次数时，一般不超过50代，细胞停止繁殖而死亡。 无限细胞系：指细胞群体在体外条件满足生长环境时，则可无限生长存活下去。 体外培养培养基 培养基包括合成培养基和天然培养基 合成培养基 主要成分包括：氨基酸、碳水化合物、维生素、无机盐类等。现市售的培养基包括MEM Eagle、199、RPMI1640、DMEM、F12等。实验室比较常用的培养基有RPMI 1640、DMEM、F12 体外培养培养基 天然培养基 天然培养基包括体液、组织提取液。其种类有血清、水解乳蛋白和胶原等 血清 血清在组织培养中是最常用的天然培养基，在任何细胞培养中都不可缺少。合成培养基只能维持细胞短时间内生存，只有补充血清后细胞才能增殖并进行一定的功能活动，所以大多数细胞培养液中必须加入一定比例的血清。常用的血清有牛血清（牛血清又分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清）、马血清、鸡血清和人血清等。 细胞传代所需消化液 经常使用的是胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二（EDTA）两种溶液，它们是传代细胞时用以使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞。它们可以单独使用，也可按一定比例与胰蛋白酶混合一起使用，这主要根据细胞的要求，可自行试验以做取舍。另外，用于原代细胞培养时，常常会使用胶原酶和胰蛋酶混合一起使用。 胰蛋白酶溶液 胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处 保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的。经常使用的有1：125 和1：250 的两种浓度。胰蛋白酶溶液在Ph7.5，温度为37℃时，作用能力最强。钙、镁离子可降低胰蛋白酶作用，所以在配制胰蛋白酶时常用无Ca2+、Mg2+的溶液配制 EDTA 溶液 EDTA 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离解作用，并且毒性小，价格低廉，使用方便。使用浓度一般为0.02%，用无钙、镁盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，室温或4℃冰箱保存。 组织培养的污染 组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。应用组织培养进行研究工作，除需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。一项好的研究，或建成的满意细胞系，往往由于遭受污染而前功尽弃。因此，一个组织培养工作者，要始终注意防止污染。 污染途径与预防 空气：空气是扩散微生物的主要途径。由于空气流动性大，在操作场地与外界隔离不严和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此，培养设施不宜置于通风场所。现各实验室普遍应用净化工作台，可防止不洁空气污染。细胞培养室可采用空气熏蒸法经常消毒。 污染途径与预防 清洗消毒：培养器皿和容器洗刷消毒不彻底、培养用液灭菌不彻底等，瓶口消毒不严格，都可导致污染。细胞培养