mf13m5pblue-t载体连接试剂盒-聚合美生物.doc

M5 pBLUE-T载体连接试剂盒 使用说明书 产品名称 单位 货号 M5 pBLUE-T Cloning Kit 20T MF133-01 M5 pBLUE-T Cloning Kit 4×20T MF133-04 【储存条件】 长期保存，请置于-20?C，有效期6个月。使用后请及时放入-20?C保存以保证酶的活性。 【产品简介】 Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’-末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3’-末端后带有一个突出碱基T的载体方便地进行克隆。pBLUE-T 载体来源于pBlueScript II SK(+) 质粒，在EcoRI酶切位点处添加了适当序列，经XCM I 酶切后其3’末端直接产生未配对的T碱基而成，因此有更高的重组效率。 pBLUE-T 载体插入位点两端独特设计的两个ECOR I位点使插入片段可以用廉价高效的ECOR I单酶切检测； 同时pBLUE-T 载体不含NdeI或NcoI限制性内切酶位点，可方便用于克隆含上述酶切位点的基因。此外，本公司载体连接体系还有背景低（蓝斑小于10%），重组率高（白斑中超过90%有插入片段），可快速连接等特点。本说明书末列出了pBLUE-T 载体相关的技术资料，其全序列可参照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位点处序列稍有不同。 测序可以采用T3、T7启动子引物和M13通用测序引物（见后面图谱） 【产品组份】 20T 4×20T pBLUE-T Vector (30ng/μl) 20μl 80μl 1000bp Control（30ng/μl） 5μl 5μl 10x PEG Enhancer 50μl 200μl 【操作步骤】 1. 连接反应的准备： 使用能在PCR产物末端加一个突出的3’-A的酶系列扩增（如Taq、TaqHiFi、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA Polymerase）。 PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行连接反应，无需纯化；如果有非特异扩增，建议胶回收纯化（货号：MF029)。如果是以质粒为模板的PCR产物，也必须进行切胶纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。 2. 连接反应： 1) 在冰上下建立如下体系（10μl体系）： 纯化后的PCR产物/或者1μl 1000bp control X* μl M5 pBLUE-T Vector 1 μl 10x PEG Enhancer 1 μl 10x Ligation Buffer（用前充分溶解混匀） 1 μl T4 DNA Ligase（5 U/μl） 0.5-1 μl 灭菌水补齐到 10 μl 加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底。 * 一般PCR产物与载体的摩尔比优化至2:1~10:1（推荐3:1）就可以得到良好结果（具体算法见后面） 2) 16?C连接过夜（一般可在PCR仪器或者水浴锅中完成）。 通常推荐16?C连接过夜（10μl体系标准连接酶量为2.5 Weiss Units即可），可以得到最多的转化子。但是本系统含PEG Enhancer可以提高连接效率数倍，在高连接酶量的情况下（10μl体系推荐连接酶量为5 Weiss Units）16?C连接30分钟即可达一般研究的要求。 3) 连接产物可直接转化感受态细胞或贮存于-20?C。如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。 3. 转化： 1) 50-100μl感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约1分钟左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。 2) 加入5μl连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀，冰上放置30分钟。42?C水浴热激90秒，冰上放置2-3分钟。 3) 加300-500μl LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37?C 150 rpm振荡培养60分钟。 4) 将200μl细菌涂布在预先用16μl 50mg/ml IPTG和40μl 20 mg/ml X-gal 涂布的氨苄青霉素平板上。 涂布细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率