[农学]第二章 基因工程制药 part1.ppt

第二章 基因工程技术制药 一、概 述---几个概念 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 终止子 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长 短不一的mRNA混合物，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增 加，外源基因本身的转录效率下降。 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域， 如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可 能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性。 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程无谓的能量 消耗。 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而 大大降低外源基因编码产物的翻译效率。 终止子 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的TΦ。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体 终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。 核糖体结合位点 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 核糖体结合位点 核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5‘UAAGG AGG 3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，他通过识别大肠杆 菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3‘AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻 译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读 框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译 起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区5’端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响 一般来说mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG） 序列与16S rRNA 的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序 列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基序列尤为重 要。上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效 率大幅度降低。 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列与起始密码子之间的序列影响 SD序列下游碱基若为AAAA或UUUU，翻译效力最高； 而CCCC或GGGG 的翻译效率则分别最高值的50%和25%。 紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。 对于大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA 而言，在这个位置 上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或 AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列与起始密码子之间的距离的影响 SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖 体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处， 在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均导致翻译起始 效率不同程度的降低。 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始tRNA 分子可以同时识别AUG、GUG 和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。 除此之外，从AUG开始的前几个