HLA分型.ppt

第十六章人类白细胞抗原分型检测技术 第一节、概述 主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC): 位于哺乳动物某一染色体上的编码主要组织相容性抗原的一组紧密连锁的基因群。 * 人类MHC → HLA复合体 → 编码HLA抗原; * 小鼠MHC → H-2复合体 → 编码H-2抗原; HLA (human leukocyteantigen)复合体 HLA复合体位于人第六号染色体短臂, 有100余个基因座(locus)，按其产物的结构、分布与功能分为三群。 定位：HLA复合体位于第6号染色体短臂上，占人基因组的1／3000，全长3600Kb，包括224个基因座位，128个功能性基因，96个假基因。 组成 ： 1．HLA-I类基因 * 经典I类基因: HLA-A、-B、-C 参与递呈内源性抗原 *非经典I类基因: HLA-E、-G、-F 2．HLA-II类基因 *经典II类基因: HLA- DP 、-DQ、- DR参与递呈外源性抗原 *非经典II类基因: LMP、TAP、tapasin、 HLA-DM、HLA-DO， 参与抗原的加工和转运 3. HLA-Ⅲ类基因 * 包括编码补体C4、Bf、C2的基因 * 编码炎症相关分子TNF、HSP70等基因 第二节、HLA血清学分型法 原理：应用一系列已知抗HLA的特异性标准分型血清(抗体)与待测淋巴细胞混合，借助补体的生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。因血清和淋巴细胞用量很少，称为补体依赖的微量细胞毒（micro-complement dependent cytotoxicity，CDC）试验，用此法测的Ag称SD-Ag（serologically defined antigen），包括HLA-A、-B、-C、-DR、-DQ。 原理 当末梢LC加入含有各种已知抗HLA标准血清的微孔板（定型血清板）中时，LC与相应的HLA-Ab结合，继而在兔补体的作下细胞被溶解。 溶解的细胞即具有与此抗体特异性结合的抗原细胞，被台盼蓝或伊红着染，而活细胞不着色。从已知的HLA特异性Ab，推断LC所表达的HLA抗原的型别。 操作步骤 1、分离外周血淋巴细胞。 2、取定型血清板，作好标记。 3、加抗血清和待检的淋巴细胞悬液，混匀，设阴、阳性对照组，温育反应。30min。 4、加兔补体，温育，60min，Ag-Ab复合物激活补体，使带有特定HLA抗原的淋巴细胞死亡。 5、加苔盼蓝或伊红染色液，死细胞着色。 6、结果判定 注意事项： 1、血清学分型法关键在于获得各种HLA分型的标准抗体。HLA分型抗体主要来自经产妇外周血、胎盘血和多次输血者的外周血经分离获得。 2、本试验采用的分型血清板，要求抗血清种类覆盖本民族或本地区80%以上的抗原，其中每一高频抗原相应的抗体为3份以上，低频抗原每一特异性抗体为2份以上。 3、血清学分型法需采用新鲜标本。HLA-I类抗原存在于所有有核细胞，HLA-II抗原仅存在于B细胞和其他抗原提呈细胞，因此，鉴定HLA-I类抗原可使用混合淋巴细胞，但检测HLA-II类抗原时需分离外周血B淋巴细胞。分离足够B细胞，标本需要量较大，B细胞的纯度也影响实验结果，纯度应在80%以上。 4、用于鉴定II型抗原的分型血清，因同时含有I类抗体，使用前应用200份随机混合的纯化血小板(只含I类抗原)进行吸收，吸收后的抗血清不应与T细胞反应。 5、补体活性也会直接影响实验结果。反复冻融补体易失活。 方法学评价： 血清学分型法简便易行，不需特殊仪器设备，便于推广；实验结果容易辨别，重复性好；试剂用量少，成本低。缺点是HLA分型血清难以获得，且存在批间差异。 第三节、 HLA细胞分型法 HLA细胞分型法分为：是以混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture, MLC）为基础的HLA分型技术，包括单向MLC和双向MLC 。主要用于HLA-D和HLA-DP位点的细胞学分型鉴定。 一、双向混合淋巴细胞培养法 (一)原理：来源于两个不同个体的淋巴细胞在体外混合培养时，如果它们的HLA抗原相同或相容，其相互刺激作用小，细胞无变化；反之，如果双方HLA抗原不相容，则相互刺激作用大，导致对方淋巴细胞的增殖，增值的程度与两个个体的抗原不配合程度成正比。 (二)技术要点 1、制备淋巴细胞悬液。 2、细胞接种与培养：试验组加入双方淋巴细胞，对照组分别加入单方淋巴细胞。培养6天或5天。 3、结果判定：形态学法和放射计数仪法。 (三)临床意义 双向混合淋巴细胞培养法不能判定具有HLA-LD的型别，