2018集美大学研究调查生 海藻基因工程.ppt

第四章 海藻基因工程;一、海藻基因工程概述;2、海藻基因工程研究的意义 （1）可有目的地改造大型海藻的遗传结构，从中筛选出所需要的优良藻种，加快海藻育种的进程 （2）由于多数藻类含有丰富的营养物质和生物活性物质，有些藻类具有耐受极端环境条件的能力，使藻类成为丰富的基因源库，可以从藻类中分离、克隆有重要经济价值的基因，作为农作物改良的目的基因或用于微生物发酵生产 （3）在部分藻类中发现的质粒，经改造后可以作为基因工程的载体，藻类病毒也有希望成为新型载体;（4）由于密码子的偏向性和启动子的通用性，藻类可能成为植物基因表达的宿主 （5）多种大型经济海藻已具相当栽培规模，转基因经济藻具备产业化基础，，特别是大型海藻有希望成为廉价高效、规模宏大的生物反应器，生产有用物质或清除海洋污染;3、海藻基因工程研究概述;研究的主要内容： （1）作为模式藻分子遗传学研究的一种手段 （2）从模式藻中分离得到具有重要应用价值的功能基因 （3）向模式藻中转入目的基因，建立应用体系 （4）建立经济藻类，如螺旋藻、小球藻和盐藻等的遗传转化模型，培育养殖新品种，利用转基因藻类反应器生产有用产品或清除污染;我国藻类基因工程研究的特点：;目前大型海藻基因工程的研究的重点应是：;二、海藻基因工程的方法学研究;目的基因的组成：;获得目的基因的途径：;1、限制性核酸内切酶酶切分离法;2、利用多聚酶链式反应（PCR）技术直接扩增目的基因;4、构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因;（2）cDNA文库; 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，即cDNA，再复制成双链cDNA片段，再按上述DNA文库的构建方法，与适当载体连接后转入受体菌进行扩增，这些受体菌的集合就称为cDNA文库;（3）从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因;;B、根据目的基因特异性表达进行分离： ;其它分离目的基因的方法：;5、转录组测序获得目的基因;（2）序列组装;（3）全长基因克隆;（二）用于基因克隆的载体 ;作为克隆载体的DNA分子必须具备以下主要条件：;1、质粒克隆载体;pUC18/19;（2）蓝藻穿梭质粒载体;（3）农杆菌Ti质粒载体——植物的克隆载体;完整的Ti质粒必须具有五个主要功能区域： ;（4）T－克隆载体和U－克隆载体 ;2、病毒（噬菌体）克隆载体;3、染色体定位整合载体;染色体定位整合载体系统包括整合平台和定位整合载体两部分 ; 定位整合载体携带的目的DNA片段（可以是只含有一个目的基因，或者是含有目的基因加上一个报告基因）进入受体细胞后，通过同源DNA片段核苷酸序列之间的交换，把外源DNA片段定位整合到整合平台DNA区域，随受体细胞染色体DNA的复制而复制，从而改变受体生物的遗传性状 ;4、人工染色体克隆载体; 筛选第一受体的转化子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的转化子，常用与受体互补的营养缺陷型 ;（三）目的基因导入受体细胞的途径;氯化钙诱导转化转化;电 击 转 化;（2）转导（transduction） ;转导过程模式图;（3）三亲本杂交接合法;非接合型质粒：能自我复制，但不含转移基因组，因此这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞 ;迁移作用的具体作法：;三亲本杂交模式图;2、重组DNA分子导入植物细胞;（2）重组DNA直接转移法;① 多聚物介导法：;② 电穿孔（electroporation）转化法：;③ 激光微束穿孔转化法：;④ 显微注射法（microinjection）：;⑤ 超声波介导转化法：;⑥ 基因枪法（particle gun)：;⑦ 脂质体介导法（liposome）：;（四）克隆子的筛选;克隆子筛选的必要性：;1、根据载体选择标记基因筛选转化子; 选择标记基因要具有以下特点： （1）该基因在受体细胞内的表达不会干扰转化细胞正常的代谢活动 （2）该基因的表达可以有效地保护转化细胞免受选择剂的生长抑制，并且从表型上可以明显区分转化细胞和非转化细胞 （3）要求选择剂对由转化细胞再生植株的生长发育影响较小 ;2、根据报告基因筛选转化子;作为报告基因必须具备以下特点： （1）由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别 （2）细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测 （3）报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好 ;（五）重组子的进一步鉴定;（2）根据重组DNA分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子 ;（3）根据PCR扩增片段鉴定重组子;凝胶电泳检测;（4）采用DNA杂交法鉴定重组子;方法：;（5）应用DNA芯片鉴定重组子;使用DNA 芯片的步骤 ;（6）根据DNA核苷酸序列鉴定重组子（测序）;2、根据目的基因转录产物（mRNA）鉴定重组子;;3