基因操作与技术EGFP蛋白质的克隆表达.docVIP

实验报告 基因分析和操作原理 题 目： EGFP蛋白质的克隆表达 学号姓名： 学 院： 生命科学学院 专 业： 生命基地 班 级： 生命基地91班 2012年6月6日 一、实验目的 学习目的基因片段的PCR及其产物回收的原理与方法。 学习目的基因的双酶切、与载体的连接及其转化的原理与方法。 重组子的鉴定及筛选的原理与方法。nhanced Green Fluorescent Protein 增强绿色荧光蛋白, EGFP是GFP突变系 目前应用较多的是 GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋 白( E G F P )( 6 4位苯丙一亮)，发射出的荧光强度 比G F P大 6 倍以上，因此，比G F P更适合作为 一种报告基因来研究基因表达、调控 细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等 绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表,生存历史超过1.6亿年。1962年,下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。 发光机理 当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。绿色荧光蛋白分子绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。通过显微镜观察这种发光的“标签”,科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。在一个活体中有数万种不同的蛋白质,这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。如果蛋白机制发生故障,通常就会发生疾病。绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制,这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。在它的帮助下,科学家还能对各种细胞的命运了如指掌,比如,脑神经细胞是如何发育起来的,或者癌症细胞是如何扩散的…… 　　今天,已经有了许多新的不同的绿色荧光蛋白变体,这就进一步完善了绿色荧光蛋白作为基因标志在生物研究中的广泛应用。 这次实验使用的模板是pEGFP-C1质粒，这是一种在哺乳动物细胞内高表达的质粒，从其图谱上可以看出其有三个起始位点，分别是SV40 ori、pUC ori、f1 ori，分别是在哺乳动物细胞中复制的起始位点、在E.coli中复制的起始位点和合成单链DNA 的起始位点。有三个启动子，分别是细菌Kanr抗性基因启动子（在f1 ori序列后面）、pSV40、pCMV（人类巨细胞病毒启动子），分别用于启动Kanr基因、Kanr/Neor抗性基因、EGFP。因为pEGFP-C1中启动EGFP的启动子只在哺乳动物细胞中才能起作用，所以pEGFP-C1质粒只能在E.coli中存在和复制，而不能表达EGFP。pEGFP-C1质粒在E.coli中可以表达Kanr和Neor，可以使用这两种抗生素进行质粒的筛选。质粒上还有多克隆位点（MCS）、HSV TK polyA、SV40 polyA等序列。 表达载体pRSET 因为pEGFP-C1质粒在E.coli中只能存在和复制，而不能表达EGFP，所以将其EGFP序列转移到可以表达的载体上进行表达。pRSET载体含有相应的启动子，可以表达EGFP基因。 表达框架结构（以A为例说明位置）： T7启动子（20-39） 6组氨酸（112-129） T7基因10前导序列(133-162) Xpress抗原位(169-192) MCS(202-248) T7反向引物(295-314) T7转录终止子 (256-385) T7基因10前导序列(133-162）：提高蛋白质稳定性。 载体上有氨苄青霉素抗性基因，可以用来筛选。 pRSET有三种，分别是A、B、C，其序列稍有不同。在克隆位点上进行双酶切时，上游用BamH I，下游用EcoR I，为了使连接后的EGFP能有正确的阅读框并成功表达，需要选择正确的酶切位点和pRSET。 pRSET A、B、C的MCS差别： pRSET A接第一位: ~AAG GAT CGA