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导 师 刘华钢教授 2004级 罗丹 * 一 立论依据本课题的研究背景及意义 目前，天然化合物的开发研究越来越受到重视，其在化学结构的多样性、复杂性、以及在生物活性方面的显著优势而成为发现创新新药的捷径 * 广西天然药物资源丰富，虽然中成药产品品种较多，但本地区地道传统中药品种在中药有效性、活性定位等方面研究还缺乏系统性，严重影响相关新药开发、生产和质量的控制。 * 目前用于临床的抗肿瘤药存在选择性差，免疫抑制及不良反应多而严重等缺点 中药抗肿瘤以其多靶点、多环节、多效应的特点，同时其毒副作用低，能提高机体免疫力，不易产生耐药性，而成为近年来研究的热点 * 本课题的研究将本地区地道传统中药品种的抗肿瘤有效成分、作用机理、毒理及代谢过程作为研究重点，为新药开发过程中的质量控制提供理论支持，加速中药现代化进程，力争高效率的开发出具有自主知识产权的中药新药和创新化学药品 * 本课题选用药物来源 白花丹（Plumbago Zeylanica L）属蓝雪科蓝雪属，别名白雪花，为亚灌木状草本。味辛苦，性温，微毒，全株供药用。我国南部和西南部均有分布，资源丰富。广西民间用于散疮、消肿、痛经活络、并治蛇伤、风湿、乳腺炎以及慢性气管炎等症 。文献报道有抗肿瘤作用。 两面针，又名入地金牛、入山虎、两背针，来源于芸香科植物两面针（Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.）的干燥根，中国药典从1995年版开始收载，为我国南方常用中药。能行气止痛、活血化瘀、通络祛风。主治跌打、风湿痹痛、牙痛、胃痛、毒蛇咬伤，外用治汤火烫伤等。其化学成分主要有苯骈菲啶类生物碱、黄酮类、木脂素类等。两面针提取物的主要药理作用有抗炎、镇痛、抗肿瘤、解痉及心血管系统等方面 * 药物的合成 对已筛选、分离鉴定出的白花丹、两面针的抗肿瘤有效成分（单体），从整体思想出发，运用配位化学的原理和组合化学的方法使之与一些其金属配合物已被用于治疗肿瘤的临床应用或临床试验的金属离子或多金属氧盐，合成系列金属配合物，以增加作用靶点 。 * 国内外研究现状 国内对白花丹研究不够系统，对其有效成分作用机理只是停留在简单药理作用研究 国外鲜见此方面研究报道。 国内对两面针研究主要集中在两面针碱提取物的简单利用，如消炎药、两面针牙膏、镇痛药等。国外对两面针的研究已处于领先阶段，如日本有些研究已达到临床试验阶段 * 二、研究目标 筛选出抗肿瘤活性较好的天然化合物和配合物，并初步给出这些天然化合物和配合物的药效学和毒理学评价，为进一步研究临床应用的可能性提供依据 * 三、研究内容 将合成的几十种天然化合物和配合物通过对人类肿瘤细胞的生长抑制实验（MTT法、SRB法等）快速筛选出有效的配合物，求出IC50确定进一步实验的配合物 进行体外毒理学实验，通过原代培养的大鼠肝细胞及骨髓细胞初步了解筛选有效的天然化合物和配合物对正常肝细胞和骨髓细胞的毒性作用 * 在合作单位提供合理的药物剂型的基础上，进行急性毒性实验、得出动物半数致死量（LD50）观察药物的中毒表现 采用小鼠荷瘤动物模型，观察被试药物对肿瘤的抑制作用，摸索出有效的少毒剂量，通过计算得的肿瘤抑制率，评价被试药物的抗肿瘤效果 * 四、拟采用的研究方法、关键技术指标及解决途径 ㈠ 针对白花丹、两面针分离出的天然化合物和用组合化学的方法合成的金属配合物，进行对人类肿瘤细胞的生长抑制实验 肿瘤细胞的培养：从国内或国外进口的人类肿瘤细胞株（KB、SGC7901、Hela、A549 等）采用DMEM或RPMI1640培养基，添加10%－20%胎牛或新生牛血清，在37℃，5％CO2，环境培养箱培养。 体外药物敏感实验：取对数生长期的各种肿瘤细胞，以某浓度通过MTT法快速得出各种被试药物相对于各个肿瘤细胞的在该浓度下的细胞生长抑制率，以此为基础设立浓度梯度分别应用SRB法、MTT法、集落形成实验法求出有效药物的IC50以确定进一步实验的化合物。 * ㈡对初步筛选出来的各种药物同时进行体内和体外的毒理学实验 使用两步灌流法分离培养原代正常大鼠肝细胞。通过测定培养皿乳酸脱氢酶(LDH)的释放量来反映细胞膜的完整性，即细胞活性，以大鼠白蛋白和尿素的生成量来反映细胞的肝功能水平，考察被试药物对体外培养大鼠肝细胞的毒性。LDH以比色法测定，尿素氮以二乙酰－肟法测定，大鼠白蛋白以酶联免疫(ELISA)法测定。 取正常大鼠骨髓细胞体外培养，给药后作染色观察各系细胞的集落情况，通过电镜观察细胞的调亡或坏死情况 通过急性毒理学实验观察动物有那些中毒表现，毒性反应出现的速度，中毒死亡过程的特征，推测死亡原因和可能的毒性靶器官。同时观察被试