蛋白质工程--5蛋白结构解析幻灯片.ppt

第五章: 蛋白结构解析 第一节　X-射线晶体结构分析 第二节　核磁共振波谱的溶液结构解析 第三节　蛋白质结构预测 第一节　X-射线晶体结构分析 概念—基本原理 1). X-射线衍射分析所依赖的基本原理是x射线衍射现象；利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特征来分析晶体结构 原理：当一束X射线照射到晶体上，首先被电子所散射，每个电子都是一个新的辐射波源，向空间辐射出与入射波同频率的电磁波。由于这些散射波之间的干涉作用，使得空间某些方向上的波始终保持相互叠加，于是在这个方向上可以观测到衍射线，而另一些方向上的波则始终互相抵消，于是就没有衍射线产生。X射线在晶体中的衍射现象，实质上是大量的原子散射波互相干涉的结果。 晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。一个衍射花样的特征，可以认为由两个方面的内容组成： 衍射线在空间的分布规律，称之为衍射几何，衍射线的分布规律是晶胞的大小、形状和位向决定。 衍射线束的强度，衍射线的强度则取决于原子的品种和它们在晶胞中的位置。 X-射线晶体结构测定程序 I. 样品制备 II. 蛋白质结晶和晶体生长 1). 蛋白质结晶原理 2). 晶体生长过程 3). 蛋白质晶体生长的影响因素：温度、重力、压力 4). 蛋白质结晶方法：批量结晶法、透析法、液相扩散法、气相扩散法 5). 蛋白质晶体的初步鉴定 第一节　X-射线晶体结构分析(续2) III. 晶体衍射数据收集和处理 1). 晶体的收集和储存 2). X-射线源的选择 3). 衍射数据的处理 第一节　X-射线晶体结构分析(续3) IV. 确定相位 1). 分子置换法 2). 多对同晶置换法 3). 多波长反常散射法 4). 单对同晶型置换法 5). 单波长反常散射法 第一节　X-射线晶体结构分析(续4) V. 模型的建立和修正 1). 电子密度修饰：很难判断一个电子密度图的正确性， 2). 分辨率：X射线衍射所能达到的最高分辨率是λ/2 3). 分析电子密度图 4).全自动化程序发展前景 第一节　X-射线晶体结构分析(续5) VI. 结构模型精化 1). R 因子: 结构振幅观测值和计算值一致性的一个度量 2). 限制性最小二乘修正 3). 全自动化软件 4). 结构模型表达 X-ray研究蛋白质的3-D结构 x-ray照射結晶，產生布拉格繞射，得到繞射分析圖 振幅amplitude 相角α 由電腦分析繞射圖，可得繞射波的強度Ｉ ＋ 结构因子F (structure factor) 经过Forier 变换之后 多張電子密度圖(electron density map)比較 回顾: NMR现象发现于1945年，发展迅速，已成为当代研究物质结构最有力的工具 1946年哈佛大学Purcell小组和斯福大学Block小组几乎同时观测了石蜡中质子的信号， 1952年获诺贝尔物理奖。 1951年发现化学位移现象。 1952年Hahn等发现自旋偶合现象，显示NMR技术可用来研究分子结构。 1958年第一台30MHz(CW-30MHz)。 第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析 1965年提出快速FT变换方法。 1966年R.R.Ernst等实现了FT-NMR实验。将信号采集由频率域→时域，使信号累加变得容易，大大提高NMR灵敏度，13C核的测量成为可能，这是一次革命。 利用不同的脉冲组合来加工核自旋体系的信息，获得特定的分子结构信息：驰豫时间，共振峰的分类（DEPT，1NEPT） 1971年J.J.Jeener首次引入二维谱的概念。 1974年R.R.Ernst小组首次成功地实现二维实验，NMR进入全新时代。 上世纪80年代是NMR迅速发展的十年。 1991年R.R.Ernst本人获诺贝尔化学奖。 仪器的基本构造 Data processing rf console Transmitter Receiver Magnet Sample tube Probe rf pulse B0 Sample tube inside coil FT Spectrum FID 核磁共振方法测定蛋白质结构的实验技术样品处理 样品分析前，必须精制充分，不应含有铁和其它杂质。 黏度不要过高（影响驰豫时间），黏度越大，分辨率越差，样品可适度稀释来提高分辨率。 溶剂 对样品要有足够的溶解度： 对1H谱一般需要5mg， 13C 谱最好用10~15 mg。 与样品不发生化学反应。 溶剂的吸收峰对样品信号没有干扰 二、标准参考样 外标准法和内标准法 NMR测定蛋白质结构的基本实验步骤：1. 样品制备，一般应采用液态样品2. 一维NMR实验，测定HNMR谱图3. 二维NMR实验，进行序列识别4. 三维NMR实验，以识别更多