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Shaanxi University of Chinese Medicine 细胞凋亡, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和标记物（荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物）标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。 原理： (二) TUNEL法检测 Shaanxi University of Chinese Medicine 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征。 可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞。 荧光素FITC标记 辣根过氧化物酶标记、 DAB显色 Shaanxi University of Chinese Medicine Shaanxi University of Chinese Medicine 线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，但是一旦线粒体??mt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的改变说明线粒体内膜电负性的变化。 (三) 线粒体膜势能（??mt）的检测 检测方法：通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞计检测细胞的荧光强度。 Shaanxi University of Chinese Medicine JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。 在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光； 在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。 常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。 原理： Shaanxi University of Chinese Medicine ????????JC-1单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。???? 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧。 凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。暴露在细胞外环境中。 Annexin-V是一种分子量为35?36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，显示绿色荧光; 细胞膜及核膜破裂，PI进入核区与DNA结合，显示红色荧光。 (四) Annexin-V -PI的检测 原理： 磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析 Shaanxi University of Chinese Medicine Shaanxi University of Chinese Medicine 　检测方法 ： 　1 悬浮细胞的染色：进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）； 　2 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 Shaanxi University of Chinese Medicine Shaanxi University of Chinese Medicine Annexin-V -PI的检测 Annexin V-FITC Fluorescence PI Fluorescence Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium Shaanxi University of Chinese Medicine 在凝胶电泳上表现为形成180?200b