[工程科技]第六章核酸分子杂交-2005-4-LXG.pptVIP

用一已知的DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交应用 基因克隆的筛选 酶切图谱的制作 基因组中特定基因序列的定量和定性分析 基因突变分析 疾病的诊断 第一节 核酸探针及其标记 寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 高度灵敏性 标记物与核酸探针分子的结合，不影响探针的主要理化特性，绝对不能影响其碱基对特异性 具有较高的化学稳定性，能耐较高温度和保存时间 检测方法具有高度特异性 标记及检测方法简单 对环境无污染，对人体无损伤 价格低廉 灵敏度极高 放射性核素对各种酶促反应无任何影响,也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质 极高的特异性 无放射性污染 稳定性好,可较长时间存放 生物素化核苷酸的制备:酶法(U)与化学法(C) 生物素标记方法:参入标记法(随机引物法或缺口翻译法)与光敏生物素标记法 生物素探针的检测体系 探针DNA标记:Dig+dUTP→ Dig-dUTP Dig-dUTP标记DNA方法: 切口平移法与随机引物标记法 检测方法: Dig-DNA探针+抗Dig抗体-ALP或HRP+底物（BCIP+NBT） 二、核酸探针的标记方法 1. DNA的切口平移标记法 1. DNA的切口平移标记法 1. DNA的缺口平移标记法 2. DNA的随机引物标记法 2. 随机引物标记法 随机引物标记法（4’51’’） 3. RNA探针的标记（略） 4. DNA的末端标记 (2) DNA的3′末端标记 根据反应原理确定同位素反应底物名称 订购同位素32P的地址 三、标记探针的纯化 第二节 核酸分子杂交的种类与方法 液相杂交 固相杂交 （最常用） 一、固相支持物与印迹方法的选择 膜印迹杂交成败的关键： 选择良好的固相支持物 有效的转移方法 印迹方法的选择 电转移 现在主要使用带电荷的尼龙膜作为电转移的DNA支持载体 完全转移所需的时间取决于： DNA片段的大小 凝胶的孔隙度 外加电场的强度 真空转移 使用真空转移装置 可快速并定量转移 NC膜或尼龙膜均可 二、Southern印迹杂交 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517. Southern印迹杂交法 常用的实验条件的选择 封闭探针在滤膜表面上的非特异性结合试剂有：Dehardt试剂，肝素和脱脂奶粉。 5×Dehardt(Ficoll 0.1g PVP 0.1g, BSA 0.1g), 0.5%SDS, 100μg/ml 鲑精DNA混合试剂比较常用。 0.25%脱脂奶粉(0.05 × BLOTTO)也较常用。 Dehardt试剂用于尼龙膜更为有效. 杂交炉 杂交炉 杂交炉 杂交炉 三、Northern印迹杂交 Northern印迹杂交程序 Northern blot　结果 四、RNA的斑点或狭线杂交 五、核酸原位杂交 原始文献出处： 限制性内切酶消化DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段→转印到NC膜或尼龙膜→碱变性、中和→预杂交、杂交→放射性自显影 定义 Southern印迹杂交是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。 程序 基本原理 -------------毛细管转移 M 1 2 1 2 与探针同源杂交的基因DNA片段 基因组DNA DNA酶切片段 内切酶 NC或尼龙膜 10×SSC 转移缓冲液 Whatman滤纸 凝胶 Whatman滤纸 纸巾 玻璃板 重物 支持物 500g NC膜或尼龙膜 Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354 原始文献出处 名称相对于Southern blot 将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。 （一）实验准备 （二）制备凝胶 （三）样品的处理 （四）